Present†Current address: OX11 0DE, UK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
An reaction center light-harvesting complex 1 (RC-LH1) iyo an pangenot na photosynthetic component kan purpura phototrophic bacteria. Nag-introdusir kami nin duwang estruktura nin cryo-electron microscopy kan RC-LH1 complex gikan sa Rhodopseudomonas palustris. An 2.65-Å na estruktura nin resolusyon kan RC-LH114-W complex igwa nin 14 subunit LH1 loops na nakapalibot sa RC, na napuputol kan protina W, mantang an complex na mayong protina-W kumpletong RC na komposisyon na nakapalibot sa RC. Sinara an 16 subunit LH1 loop. An pagkumpara kan mga estrukturang ini nagtatao nin mga pananaw sa dinamika kan quinone sa RC-LH1 complex, kaiba an mga dai pa nadeterminaran na mga pagbabago sa konpormasyon kun nagbubugkos nin quinone sa RC QB site, siring man an lokasyon kan mga auxiliary quinone binding sites, na nakakatabang na ipasa sinda sa RC. An pambihirang estruktura kan W protein nag-uulang sa pagsara kan LH1 loop, sa siring naggigibo nin sarong kanal para sa pagparikas kan pagbalyo nin quinone/quinolone.
An enerhiyang itinatao kan photosynthesis kayang susteniran an haros gabos na buhay sa kinaban, asin igwa ining dakulang potensyal para sa solar biotechnology. Mantang pigpapauswag an pankinaban na photosynthesis, an mga bakteryang lila na phototrophic nagpapahiling man nin manlaen-laen na paagi nin enerhiya asin mga kakayahan sa metabolismo. Pwede nindang maibitaran an photosynthesis asin magtalubo bilang heterotrophic na bakterya sa diklom, pwedeng mag-ayos nin nitroheno asin carbon dioxide, magprodusir nin hidroheno, asin magdegrado nin mga aromatic compound (1-3). Tanganing magtao nin enerhiya para sa mga prosesong ini, an liwanag dapat na marikas asin episyente na makombertir sa enerhiyang kemikal. An prosesong ini nagpopoon kun an light-trapping antenna complex nagsusupsop nin liwanag asin nagbabalyo kan nakukulong na enerhiya pasiring sa reaction center (RC), sa siring nagpopoon an pagbubulag kan karga (4 – 7). An pundamental na yunit nin photosynthesis sa lilang phototrophic na bakterya kompuesto kan tipo 2 RC, na napapalibutan kan light-harvesting complex 1 (LH1), na nagpoporma kan RC-LH1 core complex. An LH1 napoporma sa paagi nin sarong array nin mga kurbadong αβ heterodimers, na an lambang saro kaini nagbubugkos nin duwang bacterial chlorophyll (BChl) a molekula asin saro o duwang carotenoids (8-12). An pinakasimpleng LH1 antenna igwa nin 16 o 17 αβ heterodimers na nakapalibot sa RC (9-13) sa sarong saradong loop, alagad sa ibang mga core complex, an mga transmembrane peptide nag-uulang sa pagpapadagos kan nakapalibot na LH1 , Sa siring nagpapauswag kan quinol/quinone diffusion sa pag-ultanan kan RC asin cytochrome bc complex (1111, 13). An lilang phototrophic na tinanom na Rhodopseudomonas (Rps.) sarong modelong organismo na nakakasabot kan enerhiya asin pagbalyo nin elektron na nagsusuporta sa photosynthesis. An enot na kristal na estruktura kan Rps. An modelo kan palustris RC-LH1 complex iyo an RC, na napapalibutan nin 15 heterodimeric LH1 loops, na napuputol nin sarong dai aram na protina na inaapod na "Protein W" (14). An Protein-W sunod na nabisto bilang RPA4402, na sarong dai pa nabibisto na 10.5kDa na protina na may tolong pigprediktar na transmembrane helices (TMH) (16). Ipinagproponer niamo na liwaton an pangaran kan rpa4402 gene na nag-eencode kan protina W sa pufW tanganing magin kapareho kan nomenklatura na ginagamit para sa mga gene na nag-eencode kan RC-L, M (pufL, pufM) asin LH1α, β (pufA, pufB) na mga subunit. Interesante, an protina-W yaon sana sa mga 10% kan RC-LH1, na nagpapahiling kan Rps. an palustris nagpoprodusir nin duwang magkaibang RC-LH1 na mga komplikado. Digdi, ibinareta niamo an halangkaw an resolusyon na cryo-EM (cryo-EM) na mga estruktura kan duwang core complex, an saro may protina W asin 14 αβ heterodimers, an saro pa na mayong protina W asin sarong saradong 16 Heterodimer LH1 loop. An samong estruktura nagrerepresentar nin sarong lakdang na pagbabago sa pagsabot kan RC-LH1 complex kan Rps. palustris, huli ta inanalisar niamo an magkaparehong populasyon kan lambang variant asin igwa nin supisyenteng resolusyon tanganing malinaw na itao an lambang peptide asin mga nakabugkos na pigment asin mga kaugnay na lipid asin quinones. An pagkumpara kan mga estrukturang ini nagpapahiling na an tolong TMH proteins-W na dai pa nakua sa arin man na ibang RC-LH1 complex sagkod ngonyan nagbubunga nin sarong quinone channel tanganing maparikas an quinone/quinolone exchange. An nagkapirang konserbadong lipid asin quinone binding sites namidbid, asin nahayag niamo an sarong bagong pagbabago sa konpormasyon pagkatapos kan kombinasyon kan quinone asin RC, na pwedeng angay para sa photosystem II (PSII) RC kan mga oxygenated phototrophic organism. An samong mga nadiskubre nagtatao nin mga bagong pananaw sa mga kinetika kan pagbugkos asin pagbalyo kan quinone/quinolone sa RC-LH1 core complex kan purpura phototrophic bacteria.
Tanganing mapadali an detalyadong pag-aadal kan duwang komplikado na makukua sa Rps. palustris, pigbubulag niamo an lambang RC-LH1 sa paagi nin mga paaging biokemikal. An protina W-deficient complex (na sa huri inaapod na ΔpufW) lininig gikan sa strain na kulang sa pufW gene (16), asin saro sanang RC-LH1 complex an pwedeng maprodusir. An protina W-containing complex piggigibo kan sarong strain. An protina W kan strain na ini pigbago na may 10x His tag sa C-terminus kaini, tanganing an protina W-containing complex epektibong maipagsararo sa kadaklan na kulang na protina W sa paagi nin pag-immobilize kan metal. An komplikado epektibong nasusuhay (16) Affinity Chromatography (IMAC).
Siring sa ipinapahiling sa Figure 1, an duwang komplikado igwa nin tolong sub-unit RC (RC-L, RC-M asin RC-H) na napapalibutan nin LH1 antenna. An 2.80-A na estruktura kan komplikado na kulang sa protina-W nagpapahiling nin 16 αβ heterodimers, na nagpoporma nin sarong saradong LH1 loop na lubos na nakapalibot sa RC, na sa huri inaapod na RC-LH116 complex. An 2.65Å na estruktura kan protina-W-na igwang komplikado igwa nin 14-heterodimer LH1 na naputol kan protina-W, na sa huri inaapod na RC-LH114-W.
(A asin B) Representasyon kan ibabaw kan compound. (C asin D) Mga nakabugkos na pigment na ipinapahayag sa mga baras. (E asin F) An mga komplikado na naobserbaran gikan sa ibabaw kan cytoplasm igwa nin mga peptide asin LH1 subunits na pigrerepresentar sa mga cartoon, asin pigbibilangan nin clockwise gikan sa protein-W gap [na kapareho kan pagnumero kan Rba. sphaeroides complex (13)]. Para sa LH1-α, an kolor kan subunit kan protina giyaw; para sa LH1-β, an kolor kan subunit kan protina asul; para sa protina-W, an protina pula; para sa RC-H, ini cyan; para sa RC-L, ini Orange; para sa RC-M, magenta. An mga cofactor pigrerepresentar kan mga baras, an berde nagrerepresentar kan BChl asin BPh a na mga molekula, an lila nagrerepresentar kan mga carotenoid, asin an dilaw nagrerepresentar kan mga molekula na UQ10. (G asin H) Pinadakula na paghiling kan protina-W gap sa katumbas na rehiyon kan RC-LH114-W complex (G) asin RC-LH116 complex (H). An mga cofactor ipinapahiling sa porma nin pagpuno nin espasyo, an chelated quinone ipinapahiling sa asul. An protein-W gap pig-highlight nin sarong asul na putol-putol na linya sa (G), asin an saradit na labot kun saen an quinone/quinolol naglalakop sa LH116 ring pig-highlight nin sarong itom na putol-putol na linya sa (H).
An Pigura 1 (A asin B) nagpapahiling kan RC na napapalibutan nin bukas o sarado na mga array kan LH1αβ heterodimers, na an lambang saro nagbubugkos nin duwang BChl asin sarong carotenoid (Pigura 1, C asin D). An mga nakaaging pag-aadal nagpahiling na an Rps iyo an LH1 complex. Sa biosynthetic pathway kan spirulina xanthin, an mga species na ini igwa nin magkakalaen na populasyon nin carotenoids (17). Alagad, an spiropyrroxanthin iyo an dominanteng carotenoid asin an densidad kaini nakakakontento. Kaya, pinili ming imodelo an spiroxanthin sa gabos na LH1 binding sites. An alpha asin beta polypeptides mga solong TMH na may halipot na panluwas na rehiyon kan lamad (Figure 1, A, B, E, asin F). Dawa ngani an densidad kan 17 na mga residue sa C-terminus dai naobserbaran, an alpha polypeptide nabanga gikan sa Met1 sagkod Ala46 sa parehong mga komplikado. An β polypeptide nabawasan gikan sa Gly4 pasiring sa Tyr52 sa RC-LH116, asin gikan sa Ser5 pasiring sa Tyr52 sa RC-LH114-W. Mayo nin naobserbaran na densidad nin 3 o 4 N-terminal o 13 C-terminal residues (Figure S1). An pag-analisar kan mass spectrometry kan pinaghalo na RC-LH1 complex na pigpreparar gikan sa wild-type strain nagpahiling na an nawawarang rehiyon iyo an resulta kan heterologous cleavage kan mga peptide na ini (Figure S1 asin S2). An N-terminal formylation kan α-Met1 naobserbaran man (f). An pag-analisar nagpahiling na an α-peptide igwa nin mga residue fMet1 sagkod Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, asin an β-peptide igwa nin mga residue Ser2 sagkod Ala53, na nasa marahay na pagkakaoyon sa mapa kan densidad kan EM na hababa an temperatura.
An koordinasyon kan α-His29 asin β-His36 ginigibo an BChls na magkaatubang; an lambang αβ heterodimer nag-aasembliya sa mga kataed kaini tanganing makabilog nin sarong bukas na loop (RC-LH114-W) o sarong saradong loop (RC-LH116) sa palibot kan RC An exciton coupled pigment array (Figure 1, C asin D). Kun ikukumpara sa 877 nm na banda kan RC-LH114-W, an 880 nm na absorption red shift kan RC-LH116 3 nm (Figure 2A). Alagad, an circular dichroism spectrum haros pareho (Figure 2B), na nagpapahiling na dawa igwa nin malinaw na pagkakaiba sa pag-ultanan kan bukas asin saradong mga loop, an lokal na kapalibutan kan BChls magkapareho nanggad. An absorption redshift pwedeng resulta kan nabawasan na thermal motion asin naglangkaw na estabilidad sa closed loop (18, 19), an pagbabago sa pigment coupling na kawsa kan closed loop (20, 21), o an kombinasyon kan duwang epektong ini (11).
(A) Ultraviolet/visible/near-infrared absorption spectrum, na an mga peak kaini minarkahan kan saindang mga katumbas na pigment asin na-normalize sa BPh peak sa 775 nm. (B) Circular dichroism spectrum na na-normalize sa BChl absorbance sa 805 nm. (C asin D) Piniling ΔA spectra gikan sa time-resolved absorption spectra kan RC-LH114-W complex (C) asin RC-LH116 complex (D). Para sa mas marahay na pagkumpara, an gabos na spectra pig-normalize sa ∆A kan −A sa 0.2 ps. (E) An rate kan cytochrome c2 oxidation pagkatapos kan irradiation sa presensya kan manlaen-laen na konsentrasyon kan UQ2 (hilingon an Figure S8 para sa hilaw na datos). (F) Sa mga selula na pinadakula sa irarom nin hababang, katamtaman o halangkaw na intensidad na liwanag (10, 30 o 300μMm-2 s-1, sunod-sunod), an protina W asin RC-L na mga subunit sa pinadalisay na komplikado asin an separadong ratio kan lamad. Determinahon an lebel kan protina sa paagi kan SDS-polyacrylamide gel electrophoresis asin immunoassay (hilingon an Figure S9 para sa hilaw na datos). Determinahon an ratio relatibo sa pinadalisay na RC-LH114-W complex. An stoichiometric ratio kan RC-L sa protina-W kan komplikado 1:1.
An mga BChls sa posisyon 1 sa deformed αβ14 loop kan RC-LH114-W (Figure 1, A, C, asin E) mas harani sa RC primary donor (P) nin 6.8Å kisa sa katumbas na BChls sa RC-LH116 (Figure. 1, B, D, asin F, asin S3); alagad, an transient absorption kinetics kan duwang complex nagpapahiling na para sa RC-LH114-W asin RC-LH116, an mga excitation energy transfer time constants gikan sa LH1 pasiring sa RC iyo an 40 ±4 asin 44±3 ps (Figure 2). , C asin D, Pigura S4 asin Table S2). Mayo man nin mahalagang pagkakaiba sa elektronikong pagbalyo sa laog kan RC (Figure S5 asin kaugnay na suplementong teksto). Nagdududa kami na an haraning pagkakapareho kan oras nin pagbalyo nin enerhiya sa pag-ultanan kan LH1 asin RC-P huli sa magkaparehong distansya, anggulo asin potensyal na enerhiya kan kadaklan na BChl sa duwang LH1 loop. Garo baga an pag-eksplorar kan LH1 energy pattern tanganing maabot an pinakahababa na distansya bakong mas marikas kisa sa direktang pagbalyo nin enerhiya gikan sa mga suboptimal na lugar pasiring sa RC. An open-loop LH1 loop sa RC-LH114-W pwede man na mag-agi nin daing kamanungdanan na thermal motion sa irarom kan mga kondisyon nin hababang temperatura para sa pag-analisar kan estruktura, asin igwa nin mas halawig na αβ14 ring conformation sa temperatura kan kwarto gikan sa distansya nin pigmentasyon kan βBChls sa posisyon kan RC 1.
An RC-LH116 complex igwa nin 32 BChls asin 16 carotenoids, asin an kabilogan na pagkaareglar kaini kapareho kan nakua sa Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) DB strain (PDB) ID079 (297) asin berdeng algae (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Pagkatapos kan pag-align, saradit sanang paglihis sa mga posisyon kan αβ heterodimers an naobserbaran, orog na an 1-5, 15, asin 16 (Figure S6). An presensya kan protina-W igwa nin mahalagang epekto sa estruktura kan LH1. An tolong TMH kaini konektado sa paagi nin halipot na mga loop, na an N-terminal nasa lado kan lumen kan complex asin an C-terminal nasa lado kan cytoplasmic (Mga Pigura 1A asin 3, A sagkod D). An protina-W kadaklan hydrophobic (Figure 3B), asin an TMH2 asin TMH3 nakikipag-interak sa LH1αβ-14 tanganing makabilog nin transmembrane surface (Figure 3, B asin E sagkod G). An interface mayormenteng kompuesto nin mga residue nin Phe, Leu asin Val sa rehiyon kan transmembrane. An mga residue na ini nakatambak nin mga hydrophobic amino acid asin αβ-14 na mga pigmento. An nagkapirang polar residues nagkokontribwir man sa interaksiyon, kabali an hydrogen bond sa pag-ultanan kan W-Thr68 asin β-Trp42 sa ibabaw kan komplikadong labot (Figure 3, F asin G). Sa ibabaw kan cytoplasm, an Gln34 kataid kan keto group kan αβ-14 carotenoids. Dugang pa, an n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) na molekula naresolberan, asin an hydrophobic tail kaini nag-abot sa interface sa pag-ultanan kan protina-W asin αβ-14, asin an lipid tail pwedeng yaon sa hawak. Narisa man niamo na an mga rehiyon nin resolusyon kan C-terminal kan protina W asin RCH haranihon na gayo, alagad bako sa laog kan sakop kan pagbilog nin mga espesipikong interaksiyon (Figure 1, A asin E). Alagad, pwedeng igwa nin mga interaksiyon sa dai pa nareresolberan na C-terminal amino acids kan duwang protina na ini, na pwedeng magtao nin mekanismo para sa pagrekrut kan protina-W sa panahon kan pag-asembliya kan RC-LH114-W complex.
(A) An protina-W, na nakaatubang sa interface kan LH1αβ14 sa pormang cartoon, igwa nin korteng baras na kadena sa gilid (pula), na ipinapahiling sa sarong parte kan electrostatic potential diagram (transparent grey surface na may contour level na 0.13). (B) Protein-W na pigrerepresentar nin sarong hydrophobic na kolor na ibabaw. An mga lugar na polar asin may karga ipinapahiling sa cyan, an mga lugar na hydrophobic ipinapahiling sa puti, asin an mga lugar na makusog na hydrophobic ipinapahiling sa orange. (C asin D) Protein-W na pigrerepresentar sa cartoon, an oryentasyon kaini kapareho kan sa (A) (C), asin pinaikot nin 180° (D). Susog sa posisyon sa pagkasunod-sunod, an mga naiiba na mga residue nag-aako nin kolor na balangaw, kun saen an N-terminal asul asin an C-terminal pula. (E) Protina-W sa parehong paghiling arog kan sa (A), asin an mga residue sa interface kan protina-W:LH1 pigrerepresentar kan mga baras na may mga nakadikit na marka. (F) An protina-W pig-ikot nin 90° relatibo sa (E) asin LH1αβ14 sa representasyon kan cartoon, asin relatibo sa mga residue kan interface sa representasyon kan bar. An mga nakabitin na residue gikan sa beta polypeptide may marka. An cofactor ipinapahiling bilang sarong bar na katumbas kan kolor kan Pigura 1, an nabulok na β-DDM ipinapahiling sa abohon, asin an oksiheno ipinapahiling sa pula. (G) An paghiling sa (F) pig-ikot nin 180°, na may mga prominenteng residue kan may marka na alpha polypeptide.
An protina-W minasalida sa sarong αβ heterodimer (an ika-15 sa Pigura 1F), sa siring nakakalikay sa pagsara kan loop asin nakakakiling kan enot na tolong αβ heterodimer. Naobserbaran na an pinakahalangkaw na anggulo nin pag-ilig kan enot na αβ-1 heterodimer relatibo sa normal na pelikula iyo an 25° sagkod 29° (Figure 1, A asin E), na nabuo kan 2° sagkod 8° na pag-ilig kan αβ-1 sa RC A matarom na kontras-LH116 (Figure 1, B asin F). An ikaduwa asin ikatolong heterodimer nakahilig sa 12° sagkod 22° asin 5° sagkod 10°, sunod-sunod. Huli sa steric hindrance kan RC, an pagkiling kan αβ-1 dai kabali an ikaduwang pares kan αβ (na katumbas kan ika-16 na αβ sa Figure 1F), kaya nagpoporma nin malinaw na siwang sa LH1 ring (Figure 1, A asin E) . Huli sa kawaran nin duwang αβ heterodimers, na may kaibang pagkawara nin apat na BChl asin duwang carotenoids, mayo sa mga carotenoids an nagbubugkos sa twisted αβ-1 subunit, na nagreresulta sa sarong LH114-W ring na igwa nin 13 carotenoids na Vegetarian asin 28 BChls. An mga lokal na pagtantiya kan resolusyon kan duwang komplikado sa αβ1 sagkod 7 na mga rehiyon mas hababa kisa sa mga iba pang parte kan LH1 loop, na pwedeng magpahiling kan inherent plasticity kan LH1 subunit na kataid kan RC QB site (Figure 4) .
An mga ritrato kan RC-LH114-W (A asin B) asin RC-LH116 (C asin D) ipinapahiling gikan sa parehong paghiling sa itaas/gilid (A asin B) (A asin C) asin ibabaw kan labot kan Fig. 1. (B asin D). An mga kolor na susi ipinapahiling sa too.
An solamenteng ibang karakteristikong core complex na may stoichiometric ratio na 1:14 iyo an Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13). Alagad, an protina W asin PufX mayo nin malinaw na pagkakapareho, asin igwa nin mahalagang epekto sa saindang kanya-kanyang estruktura nin LH1. An PufX sarong solong TMH na may N-terminal cytoplasmic domain na nakikipag-interak sa cytoplasmic na lado kan RC-H subunit (13) sa sarong posisyon na katumbas kan Rps. palustris LH116αβ-16. An PufX naggigibo nin sarong kanal para sa pagbalyo nin quinone/quinolone sa pag-ultanan kan RC-LH1 asin kan cytochrome bcl complex asin yaon sa gabos na Rba. sphaeroides core complex (13). Dawa ngani an monomer-monomer interface yaon sa Rba. An sphaeroides RC-LH1-PufX dimer namumugtak sa posisyon nin pagbugkos kan protina W sa RC-LH114-W, asin an siwang na pinukaw kan PufX asin protina-W yaon sa katumbas na posisyon (Figure S7A). An siwang sa RC-LH114-W nakalinya man sa hypothetical quinone channel (8) kan Pseudomonas rosea LH1, na napoporma kan mga peptide na bakong konektado sa protina W o PufX (Figure S7B). Dugang pa, an quinone channel sa Blc. An berdeng esmeralda na LH1 na nabuo sa paagi nin pag-eksklusibo nin sarong γ subunit (7) namumugtak sa kaparehong posisyon (Figure S7C). Dawa ngani pigpapaagi sa manlaen-laen na protina, an paglataw kan mga quinone/quinolol channel na ini sa sarong komun na posisyon sa RC-LH1 complex garo baga sarong halimbawa nin convergent evolution, na nagpapahiling na an siwang na ginibo kan protina W pwedeng magserbing quinone channel.
An siwang sa LH114-W loop nagtutugot kan pagporma nin sarong padagos na rehiyon nin lamad sa pag-ultanan kan panlaog na espasyo kan RC-LH114-W complex asin kan bulk membrane (Figure 1G), imbes na ikonektar an duwang domain sa paagi nin sarong protina pore arog kan mga protina. An RC-LH116 complex kapareho kan sarong saradong Tch. An garo dagom na komplikado (22) (Figure 1H). Nin huli ta an paglakop kan quinone sa paagi kan lamad mas marikas kisa sa paglakop sa paagi kan mahiwas na kanal nin protina, an bukas na LH114-W loop puedeng magtugot nin mas marikas na pagbalyo kan RC kisa sa saradong LH116 loop, asin an paglakop kan quinone sa RC puedeng mas limitado. Tanganing ma-test kun baga an protina W nakakaapektar sa pagkombertir kan mga quinones sa paagi kan RC, naggibo kami nin sarong cytochrome oxidation assay sa sarong partikular na konsentrasyon kan ubiquinone 2 (UQ2) (sarong analogue kan natural na UQ10 na may mas halipot na isoprene tail) (Figure 2E). Dawa ngani an presensya kan chelated quinone nakakaulang sa tamang pagdeterminar kan garo baga Michaelis constant (RC-LH114-W asin RC-LH116 angay para sa 0.2±0.1μM asin 0.5±0.2μM, sunod-sunod), an pinakahalangkaw na rate kan RC-LH114-W ( 4.6±0.202-12-1-RC) iyo an s-LH1-1. 28±5% na mas dakula kisa RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Sa primero, pigtatantya niamo na an protina-W yaon sa mga 10% kan core complex (16); digdi, an mga rate nin pag-okupar kan mga selula nin pagdakula na hababa an liwanag, katamtaman an liwanag, asin halangkaw an liwanag iyo an 15±0.6%, 11±1% asin 0.9±0.5, sunod-sunod na % (Figure 2F). An kuantitatibong pagkumpara kan mass spectrometry nagpahiling na an pagdagdag kan histidine tag dai nakabawas kan relatibong abundansya kan protina-W kumpara sa mga strain na wild-type (P = 0.59), kaya an mga lebel na ini bakong sarong artifact kan pigbago na protina-W (Figure S10). Alagad, an hababang okupasyon na ini kan protina-W sa RC-LH1 complex pwedeng magtugot sa nagkapirang RC na mag-flip sa sarong pinarikas na rikas, sa siring napapagaan an mas maluway na pagbalyo nin quinone/quinolone sa RC-LH116 complex. Narisa niamo na an halangkaw na rate nin pag-okupar kan liwanag bakong magkapareho sa pinakabagong datos kan transcriptomics, na nagpapahiling na an ekspresyon kan gene kan pufW nagdadakula sa irarom nin makusog na liwanag (Figure S11) (23). An pagkakaiba kan pufW transcription asin protina-W na paglaog sa RC-LH1 complex nakakalibog asin pwedeng magpahiling kan komplikadong regulasyon kan protina.
Sa RC-LH114-W, 6 cardiolipin (CDL), 7 phosphatidylcholine (POPC), 1 phosphatidylglycerol (POPG) asin 29 β-DDM na mga molekula an pig-alokar asin pigmodelo sa laog kaini 6 CDLs, 24 POPCs, 2 POPGs asin 21βDs. RC-LH116 (Figure 5, A asin B). Sa duwang estrukturang ini, an CDL haros namumugtak sa cytoplasmic na lado kan komplikado, mantang an POPC, POPG asin β-DDM kadaklan namumugtak sa luminal na lado. Duwang molekula nin lipid asin detergent an naisuway sa αβ-1 sagkod αβ-6 na rehiyon kan RC-LH114-W complex (Figure 5A), asin lima an naisuway sa katumbas na rehiyon kan RC-LH116 (Figure 5B ). Mas dakol na lipid an nakua sa ibong na lado kan komplikado, orog na an CDL, na natipon sa pag-ultanan kan RC asin αβ-7 sagkod αβ-13 (Figure 5, A asin B). An ibang mga lipid asin detergent na naresolber sa estruktura yaon sa luwas kan singsing kan LH1, asin an mga kadena nin acyl na naresolber na marhay minaabot sa pag-ultanan kan mga subunit kan LH1, na pansamantalang pigdesignar bilang β-DDM sa RC-LH114-W, asin tinawan nin kahulugan bilang β-DDM sa RC A na pinaghalo kan β-DDM asin PO-LH166-LH16. An kaparehong posisyon kan mga chelating lipid asin detergent sa samong estruktura nagpapahiling na sinda mga lugar nin pagbugkos na may kinaaraman sa pisyolohiya (Figure S12A). An mga posisyon kan mga katumbas na molekula sa Tch igwa man nin marhay na pagkakapareho. Maboot asin Trv. An strain 970 RC-LH1s (Figure S12, B to E) (9, 12) asin an mga hydrogen-bonding residues kan lipid head group nagpahiling nin medyo marhay na konserbasyon sa pag-align kan pagkasunod-sunod (Figure S13), na nagpapahiling na an Conserved CDL na nagbubugkos sa RC (24), an mga lugar na ini pwedeng mapreserbar sa RCH-LH1 complex.
(A asin B) An mga peptide kan RC-LH114-W (A) asin RC-LH116 (B) pigrerepresentar kan mga cartoon, asin an mga pigmento pigrerepresentar kan mga baras, gamit an kolor sa Pigura 1. An mga lipid ipinapahiling sa pula, asin an mga detergent ipinapahiling sa abohon. An UQ na nakabugkos sa RC QA asin QB na mga lugar giyaw, mantang an nakasuway na UQ asul. (C asin D) An parehong mga pananaw kan (A) asin (B), na may mga lipid na dai kabali. (E sagkod G) Pinadakulang paghiling kan Q1(E), Q2(F) asin Q3(G) gikan sa RC-LH116, na may mga kadena sa gilid na nakakaimpluwensya sa lambang saro. An mga hydrogen bond ipinapahiling bilang itom na putol-putol na linya.
Sa RC-LH116, parehong an RC QA asin QB UQ, na nagpartisipar sa pagbalyo nin elektron sa proseso nin pagbubulag kan karga, nabubulok sa saindang mga lugar nin pagbugkos. Alagad, sa RC-LH114-W, an QB quinone dai pa naresolberan asin pag-uulayan nin detalyado sa ibaba. Dugang pa sa QA asin QB quinones, duwang chelated UQ molecules (na namumugtak sa pag-ultanan kan RC asin LH1 rings) an pig-alokar sa RC-LH114-W na estruktura susog sa saindang mga well-resolved head groups (na namumugtak sa Q1 asin Q2, sunod-sunod). espasyo). Pigura 5C). Duwang yunit nin isoprene an itinalaga sa Q1, asin an mapa nin densidad nagreresolber kan kumpletong 10 ikog nin isoprene kan Q2. Sa estruktura kan RC-LH116, tolong chelated UQ10 molecules (Q1 sagkod Q3, Figure 5D) an naresolberan, asin an gabos na molekula igwa nin malinaw na densidad sa bilog na ikog (Figure 5, D sagkod G). Sa duwang estruktura, an mga posisyon kan mga grupo nin quinone head kan Q1 asin Q2 igwa nin marahayon na pagkakapareho (Figure S12F), asin sinda nakikipag-ulay sana sa RC. An Q1 namumugtak sa entrada kan W gap kan RC-LH114-W (Figure 1G asin 5, C, D asin E), asin an Q2 namumugtak harani sa QB binding site (Figure 5, C, D) asin F). An mga napreserbar na L-Trp143 asin L-Trp269 na mga residue haranihon na marhay sa Q1 asin Q2 asin nagtatao nin potensyal na mga interaksiyon sa π-stacking (Figure 5, E asin F, asin Figure S12). An L-Gln88, 3.0 Å gikan sa distal na oksiheno kan Q1, nagtatao nin makusog na bogkos nin hidroheno (Figure 5E); an residue na ini napreserbar sa gabos na RC apwera sa pinakaharayong relasyon (Figure S13). An L-Ser91 konserbatibong sinalidahan para sa Thr sa kadaklan na ibang RCs (Figure S13), 3.8 Angstroms gikan sa methyl oxygen kan Q1, asin pwedeng magtao nin maluyang mga hydrogen bond (Figure 5E). An Q3 dai minalataw na igwa nin espesipikong interaksiyon, alagad yaon sa hydrophobic na rehiyon sa pag-ultanan kan RC-M subunit asin kan LH1-α subunit 5 sagkod 6 (Figure 5, D asin G). An Q1, Q2 asin Q3 o an mga haranihan na chelated quinones naresolberan man sa Tch. Malumo, Trv. Strain 970 asin Blc. An estruktura kan iris (9, 10, 12) nagtutukdo sa sarong konserbadong auxiliary quinone binding site sa RC-LH1 complex (Figure S12G). An limang nabulok na UQ sa RC-LH116 nasa marhay na pagkakaoroyon sa 5.8±0.7 kan lambang komplikado na nadeterminaran kan high performance liquid chromatography (HPLC), mantang an tolong nabulok na UQ sa RC-LH114-W mas hababa kisa An sinukol na halaga na 6.2±0.3 (Fig. S14) nagpapahiling na mayo nin nareresolberan na mga molekula sa UQ. istraktura.
An pseudo-symmetric L asin M polypeptides igwa nin limang TMHs asin nagpoporma nin sarong heterodimer na pinagsasaro an sarong BChl dimer, duwang BChl monomers, duwang bacteriophage (BPh) monomers, asin sarong non-Heme iron asin saro o duwang UQ10 na molekula. Sa paagi kan presensya kan mga hidrohenong bogkos sa terminal na grupo nin ketone asin an aram na pagtipon kaini sa Rps, an mga carotenoid piglalaog sa M-subunit, na inaapod na cis-3,4-dehydroorhodopin. Mga klase (25). An panluwas na domain kan lamad kan RC-H nakaangkla sa lamad sa paagi nin sarong TMH. An kabilogan na estruktura kan RC kapareho kan tolong subunit RC kan mga magkaparehong species (arog kan Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). An mga macrocycle kan BChl asin BPh, an carotenoid backbone asin non-heme iron nag-oorog sa laog kan resolution range kan mga estrukturang ini, siring man an UQ10 head group sa QA site asin an QB quinone sa RC-LH116 (Figure S15).
An pagkakaigwa nin duwang estruktura nin RC na may manlaen-laen na rate nin pag-okupar sa lugar kan QB nagtatao nin bagong oportunidad na siyasaton an magkakasundo na mga pagbabago sa konpormasyon na kaiba kan pagbugkos kan QB quinone. Sa RC-LH116 complex, an QB quinone namumugtak sa lubos na nakabugkos na “proksimal” na posisyon (26), alagad an pagbubulag kan RC-LH114-W mayo nin QB quinone. Mayo nin QB quinone sa RC-LH114-W, na nakakabigla huli ta an complex aktibo, orog pa sa RC-LH116 complex na may structurally resolved QB quinone. Dawa ngani an duwang LH1 rings nag-chelate nin mga anom na quinones, lima an estruktural na naresolberan sa saradong RC-LH116 ring, mantang tolo sana an estruktural na limitado sa bukas na RC-LH114-W ring. An naglangkaw na structural disorder na ini pwedeng magpahiling kan mas marikas na pagsalida kan RC-LH114-W QB sites, mas marikas na quinone kinetics sa complex, asin mas dakulang posibilidad na makabalyo sa LH1 loop. Isinusuherir niamo na an kakulangan nin UQ sa RC QB site kan RC-LH114-W pwedeng resulta kan mas komplikado asin mas aktibong komplikado, asin an QB site kan RC-LH114-W tulos na nagyelo sa UQ turnover An espesipikong yugto (an entrada sa QB site sarado na) nagpapahiling kan konpormasyon kan aktibidad na ini.
Kun mayo nin QB, an kaibang pag-ikot kan L-Phe217 sa sarong posisyon na bakong magkakasundo sa pagbugkos kan UQ10, huli ta ini magigin dahelan nin sarong spatial collision sa enot na isoprene unit kan ikog (Figure 6A). Dugang pa, an mga malinaw na mayor na pagbabago sa konpormasyon malinaw, orog na an helix de (halipot na helix sa loop sa pag-oltanan kan TMH D asin E) kun saen an L-Phe217 ibinabalyo sa QB binding pocket asin an pagbirik kan L-Tyr223 (Figure 6A ) Tanganing putolon an hydrogen bond sa M-Ap4 framework asin isara an entrance kan pagbugkos kan QB lugar (Figure 6B). An Helix de pivot sa base kaini, an Cα kan L-Ser209 pigbabalyo nin 0.33Å, mantang an L-Val221Cα pigbabalyo nin 3.52Å. Mayo nin nahihiling na mga pagbabago sa TMH D asin E, na pwedeng ibugtak sa parehong estruktura (Figure 6A). Sa satuyang aram, ini an pinakaenot na estruktura sa natural na RC na nagsasara kan lugar kan QB. An pagkumpara sa kumpletong (QB-bound) na estruktura nagpapahiling na bago mabawasan an quinone, kaipuhan an pagbabago sa konpormasyon tanganing makalaog ini sa quinone. An L-Phe217 nag-iikot tanganing makabilog nin π-stacking interaction sa quinone head group, asin an helix minabalyo paluwas, na nagtutugot sa skeleton kan L-Gly222 asin sa side chain kan L-Tyr223 na makabilog nin sarong hydrogen bond network na may estableng hydrogen bond structure (Figure 6, A asin C).
(A) Nag-oorog na cartoon nin hologram (L chain, orange/M chain, magenta) asin apo (gray) na estruktura, kun saen an mga pangenot na residue ipinapahiling sa porma nin sarong representasyon na garo baras. An UQ10 pigrerepresentar nin sarong dilaw na bar. An tuldok na linya nagpapahiling kan mga hydrogen bond na nabuo sa bilog na estruktura. (B asin C) An representasyon kan ibabaw kan apolipoprotein asin kan bilog na estruktura kan singsing, na nagtatampok kan side chain oxygen kan L-Phe217 sa asul asin L-Tyr223 sa pula, sunod-sunod. An L subunit kolor kahel; an M asin H na mga subunit dai kolor. (D asin E) Apolipoprotein (D) asin bilog (E) RC QB sites [kolor kan (A) sunod-sunod] asin Thermophilus thermophilus PSII (berde, asul na may plastic quinone; PDB ID: 3WU2) Align (58).
Dai linalaoman, dawa ngani nagkapirang estruktura kan QB-deficient RCs na mayong LH1 an makukua, an mga pagbabago sa konpormasyon na naobserbaran sa pag-aadal na ini dai pa naireport kaidto. Kabali digdi an estruktura nin pag-ubos kan QB gikan sa Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) asin Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), na gabos haros kapareho kan saindang kabilogan na estruktura kan QB. An haraning pagsiyasat kan 3PRC naghayag na an mga molekula nin detergent kan LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) nagbubugkos sa entrada kan posisyon kan QB, na pwedeng makaulang sa pag-areglo giraray sa sarong saradong konpormasyon. Dawa ngani an LDAO dai nabubulok sa parehong posisyon sa 1EYS o 1OGV, an mga RC na ini pig-aandam gamit an parehong detergent asin kun kaya pwedeng magprodusir nin parehong epekto. An kristal na estruktura kan Rba. An Sphaeroides RC na co-crystallized sa cytochrome c2 (PDB ID: 1L9B) garo baga igwa man nin saradong QB site. Alagad, sa kasong ini, an N-terminal na rehiyon kan RC-M polypeptide (na nakikipag-ulay sa QB binding site sa paagi kan H bond kan Tyr residue sa Q helix) nag-aako nin sarong bakong natural na konpormasyon, asin an pagbabago kan konpormasyon kan QB dai na pig-aadalan pa (30 ). An nakakapakusog nin boot iyo na dai ta pa nahihiling an arog kaining klase nin depormasyon kan M polypeptide sa estruktura kan RC-LH114-W, na haros kapareho kan N-terminal na rehiyon kan RC-LH116 RC. Dapat man na mangnohon na pagkatapos kan paghale kan detergent-based LH1 antenna, an mga apolipoprotein RCs sa PDB naresolberan, na naghale kan mga internal quinone pools asin lipids sa siwang sa pag-ultanan kan RC asin kan panlaog na ibabaw kan nakapalibot na LH1 ring (31, 32). An RC nagdadanay na functional huli ta ini nagpapadanay kan gabos na cofactors, apwera sa decomposable QB quinone, na bakong gayong estable asin parating nawawara sa proseso nin pag-andam (33). Dugang pa, aram na an paghale kan LH1 asin natural na mga lipid na sikliko gikan sa RC puedeng magkaigwa nin epekto sa mga pagpunsyon, arog kan pinahalipot na lawig nin buhay kan charge-separated P+QB-state (31, 34, 35). Kaya, pig-espekulasyon niamo na an pag-eksister kan lokal na LH1 ring na nakapalibot sa RC pwedeng magmantenir kan "sarado" na lugar kan QB, sa siring napreserbar an lokal na kapalibutan harani sa QB.
Dawa ngani an apolipoprotein (mayong QB quinone) asin an kumpletong estruktura nagrerepresentar sana nin duwang snapshot kan turnover kan QB site, imbes na sarong serye nin mga pangyayari, igwa nin mga indikasyon na an pagbugkos pwedeng i-gate tanganing maibitaran an pagbugkos giraray kan hydroquinone Tanganing mapugulan an pagpugol kan substrate. An interaksiyon kan quinolol asin quinone harani sa QB site kan apolipoprotein pwedeng magkaiba, na nagdadara sa pagsikwal kaini kan RC. Haloy nang pigproponer na an mga pagbabago sa konpormasyon igwa nin papel sa pagbugkos asin pagbawas kan mga quinones. An kakayahan kan mga nagyelo na RC na mabawasan an mga quinones pagkatapos kan pag-adaptar sa madiklom na diperensya (36); An X-ray crystallography nagpapahiling na an danyos na ini huli sa mga QB quinones na nakukulong sa sarong “distal” na konpormasyon mga 4.5 Å gikan sa aktibong proksimal na posisyon (26) , 37). Isinusuherir niamo na an distal binding conformation na ini sarong snapshot kan intermediate state sa pag-ultanan kan apolipoprotein asin kan bilog na estruktura kan singsing, na minasunod sa enot na interaksiyon sa quinone asin an pagbukas kan QB site.
An tipo II RC na makukua sa PSII complex kan nagkapirang phototrophic bacteria asin cyanobacteria, algae asin tinanom igwa nin estruktural asin functional na konserbasyon (38). An pag-align kan estruktura na ipinapahiling sa Figure 6 (D asin E) nagduduon kan pagkakapareho kan PSII RCs asin kan QB site kan bacterial RC complex. An pagkumpara na ini haloy nang modelo para sa pag-adal kan mga haraning sistema nin pagbugkos asin pagbawas kan quinone. An mga nakaaging publikasyon nagsuherir na an mga pagbabago sa konpormasyon may kaibang pagbawas kan PSII kan mga quinones (39, 40). Kaya, kun iisipon an ebolusyonaryong konserbasyon kan RC, an dai pa naobserbaran na mekanismo nin pagbugkos na ini pwede man na aplikado sa QB site kan PSII RC sa mga oxygenated phototrophic plants.
Rps ΔpufW (unlabeled pufW deletion) asin PufW-His (C-terminal 10x His-tagged protein-W na ipinahayag gikan sa natural na pufW locus) na mga strain. an palustris CGA009 ilinadawan sa samong nakaaging trabaho (16). An mga strain na ini asin an isogenic wild-type parent nakua sa freezer sa paagi nin pag-streak nin sadit na bilang nin mga selula sa PYE (lambang 5 g litro -1) (na nakatago sa LB sa -80 °C, na igwa nin 50% ( w/v) glycerol) na protina, yeast extract asin succinate) agar [1.5%) (w/v) plate. An plato pig-inkubar sa bilog na banggi sa diklom sa temperatura kan kwarto sa irarom nin mga kondisyon na anaerobic, dangan pig-iilawan nin puting liwanag (~50 μmolm-2 s-1) na itinao kan OSRAM 116-W halogen bulbs (RS Components, UK) sa laog nin 3 sagkod 5 aldaw sagkod na an sarong kolonya naglataw. Sarong solong kolonya an ginamit sa pag-inokular nin 10 ml nin M22+ medium (41) na pigdagdagan nin 0.1% (w/v) na casamino acids (sa huri inaapod na M22). An kultura pinadakula sa irarom nin hababang kondisyon nin oksiheno sa diklom sa 34°C na may pagyugyog sa 180 rpm sa laog nin 48 oras, dangan 70 ml kan kultura an pigbakunahan sa irarom kan parehong kondisyon sa laog nin 24 oras. An semi-aerobic culture na may volume na 1 ml ginagamit sa pag-inoculate nin 30 ml kan M22 medium sa sarong 30 ml na unibersal na screw-top na transparent na bote nin salming asin pig-iirradiate nin agitation (~50μmolm-2 s-1) sa laog nin 48 oras sa paagi nin sterile magnetic force Stirring rod. Dangan 30 ml kan kultura an pig-inokular nin mga 1 litro nin kultura sa irarom kan parehong kondisyon, na dangan ginamit sa pag-inokular nin mga 9 litro nin kultura na naiilawan sa ~200 μmolm-2 s-1 sa laog nin 72 na oras. An mga selula inani sa paagi nin sentrifugasyon sa 7132 RCF sa laog nin 30 minutos, pigsuspinde giraray sa ~10 ml nin 20 mM tris-HCl (pH 8.0), asin itinago sa -20°C sagkod na kaipuhan.
Pagkatapos na matunaw, magdagdag nin nagkapirang kristal nin deoxyribonuclease I (Merck, UK), lysozyme (Merck, UK) asin duwang Roche holoenzyme protease inhibitor tablets (Merck, UK) sa mga resuspended cells. Sa sarong 20,000 psi French pressure cell (Aminco, USA), an mga selula nadisturbo nin 8 sagkod 12 beses. Pagkatapos na mahale an mga dai nabari na selula asin dai natutunaw na mga ati sa paagi nin sentrifugasyon sa 18,500 RCF sa laog nin 15 minutos sa 4°C, an lamad pig-precipitate gikan sa pigmented lysate sa paagi nin sentrifugasyon sa 113,000 RCF sa laog nin 2 oras sa 43,000°C. Iapon an natutunaw na fraction asin i-resuspend an kolor na lamad sa 100 sagkod 200 ml nin 20 mM tris-HCl (pH 8.0) asin i-homogenize sagkod na mayo nang nahihiling na mga aggregate. An nakabitin na lamad pig-inkubar sa 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) na igwa nin 2% (w/v) β-DDM sa laog nin 1 oras sa diklom sa 4°C na may maluyang pagpukaw. Dangan i-centrifuge sa 70°C tanganing matunaw an 150,000 RCF sa 4°C sa laog nin 1 oras tanganing mahale an mga natatadang dai natutunaw.
An solubilizing membrane gikan sa ΔpufW strain pig-aplay sa sarong 50 ml DEAE Sepharose ion exchange column na may tolong column volumes (CV) nin binding buffer [20 mM tris-HCl (pH 8.0) na igwa nin 0.03% (w / v) β-DDM]. Hugasan an kolum gamit an duwang CV binding buffer, dangan hugasan an kolum gamit an duwang binding buffer na igwa nin 50 mM NaCl. An RC-LH116 complex pig-elute gamit an linear gradient na 150 sagkod 300 mM NaCl (sa binding buffer) sa 1.75 CV, asin an natatadang binding complex pig-elute gamit an binding buffer na igwang 300 mM NaCl sa 0.5 CV. Tiponon an absorption spectrum sa pag-ultanan kan 250 asin 1000 nm, papagdanayon an fraction na may absorbance ratio (A880/A280) na mas dakula pa sa 1 sa 880 sagkod 280 nm, lasaw ini nin duwang beses sa binding buffer, asin gamiton giraray an parehong prosedimiento sa DEAE column Sa pagdalisay. Lanawan an mga fraction na may A880/A280 ratios na mas halangkaw sa 1.7 asin A880/A805 ratios na mas halangkaw sa 3.0, gibohon an ikatolong round nin ion exchange, asin papagdanayon an mga fraction na may A880/A280 ratios na mas halangkaw sa 2.2 asin A880/A805 ratios na mas halangkaw sa 5.0.0. An parsial na nadalisay na komplikado pigkonsentrar sa ~2 ml sa sarong Amicon 100,000 molecular weight cut-off (MWCO) centrifugal filter (Merck, UK), asin pigkarga sa sarong Superdex 200 16/600 size exclusion column (GE Healthcare, US) na igwa nin 200 mM NaCl buffer, dangan pig-elution sa parehong buffer. CV. Tiponon an mga spektrum nin pagsupsop kan fraksyon nin pag-eksklusibo nin kadakulaan, asin ikonsentrar an mga spektrum nin pagsipsip na may mga ratio nin A880/A280 sa ibabaw nin 2.4 asin mga ratio nin A880/A805 sa ibabaw nin 5.8 sagkod 100 A880, asin tulos na gamiton sinda para sa pag-andam o pagtipig kan cryo-TEM grid Papagdanayon sa -80°C sagkod na kaipuhan.
An solubilizing membrane gikan sa PufW-His strain pig-aplay sa sarong 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose column (20 mM tris-HCl (pH 8.0) na igwa nin 200 mM NaCl asin 0.03% (w/w)) sa IMAC buffer ( GE Healthcare). v) β-DDM]. An kolum hinugasan nin limang CVs nin IMAC buffer, dangan nin limang CVs nin IMAC buffer na igwa nin 10 mM histidine. An core complex pig-elute gikan sa kolum na may limang IMAC buffer na igwa nin 100 mM histidine. An fraction na igwa kan RC-LH114-W complex pigkonsentrar sa ~10 ml sa sarong stirred tank na igwa nin Amicon 100,000 MWCO filter (Merck, UK), piglasaw nin 20 beses sa binding buffer, dangan idinagdag sa 25 ml Sa DEAE Sepharose column, apat na CV buffer an ginamit sa b buffer na nakabugkos sa enotan. Hugasan an haligi gamit an apat na CV binding buffer, dangan i-elute an complex sa walong CV sa sarong linear gradient na 0 sagkod 100 mM NaCl (sa binding buffer), asin an natatadang apat na CV na igwa nin 100 mM binding buffer An mga residual complex na i-elute sa sodium chloride na pinagsararo sa A888/2002 ratio asin mas halangkaw kisa 2004. An A880/A805 na ratio na mas halangkaw sa 4.6 na mga fraction pigkonsentrar sa ~2 ml sa sarong Amicon 100,000 MWCO centrifugal filter, asin pinano nin 1.5 CV IMAC nin patienot Buffer equilibrated Superdex 200 16/600 size exclusion column, dangan pig-elute sa parehong buffer sa ibabaw kan 1.5 CV. Tiponon an mga spektrum nin pagsupsop kan mga fraksyon na dai pig-eksklusibo an kadakulaan asin ikonsentrar an mga spektrum nin pagsipsip na may mga ratio nin A880/A280 na sobra sa 2.1 asin mga ratio nin A880/A805 na sobra sa 4.6 sagkod 100 A880, na tulos na ginagamit para sa pag-andam kan nagyelo na grid kan TEM o itinatago sa -80°C sagkod na kaipuhan.
Sarong Leica EM GP immersion freezer an ginamit sa pag-andam nin mga hababang temperaturang TEM grids. An komplikado piglasaw sa IMAC buffer sa A880 na 50, dangan an 5μl pigkarga sa sarong bagong glow-discharged QUANTIFOIL 1.2/1.3 carbon-coated copper mesh (Agar Scientific, UK). I-inkubar an grid sa 20°C asin 60% na relatibong humidity sa laog nin 30 s, dangan i-blot ini sa laog nin 3 s, dangan i-quench ini sa likidong ethane sa -176°C.
An datos kan RC-LH114-W complex naitala sa eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) na may mikroskopyo na Titan Krios, na nagtatrabaho sa sarong nag-aakselerar na boltahe na 300kV, na may nominal na pagpadakula na 130,000× asin sarong enerhiya nin Choo-se gap na 200kV. Sarong Gatan 968 GIF Quantum na may K2 peak detector an ginamit sa pagrekord nin mga imahe sa counting mode tanganing makakolekta nin datos. An naka-calibrate na sukol kan pixel 1.048Å, asin an dose rate 3.83 e-Å-2s-1. Nakolekta an pelikula sa laog nin 11 segundo asin binaranga ini sa 40 parte. Gamiton an lugar na may patong na karbon tanganing i-refocus an mikroskopyo, dangan magtipon nin tolong pelikula kada labot. Sa kabilugan, 3130 na mga pelikula an nakolekta, na may mga halaga nin defocus sa pag-ultanan kan -1 asin -3μm.
An datos para sa RC-LH116 complex tinipon gamit an parehong mikroskopyo sa Asterbury Biostructure Laboratory (University of Leeds, UK). An datos nakolekta sa paagi nin pagbilang na may pagpadakula na 130 k, asin an sukol kan pixel pig-calibrate sa 1.065 Å na may dosis na 4.6 e-Å-2s-1. An pelikula narekord sa laog nin 12 segundo asin nababanga sa 48 parte. Sa kabilugan, 3359 na mga pelikula an nakolekta, na may mga halaga nin defocus sa pag-ultanan kan -1 asin -3μm.
An gabos na pagproseso nin datos ginigibo sa Relion 3.0 pipeline (42). Gamiton an Motioncorr 2 (43) tanganing itama an hiro kan sinag sa paagi nin dose weighting, dangan gamiton an CTFFIND 4.1 (44) tanganing determinaran an CTF (contrast transfer function) na parametro. An mga tipikal na photomicrograph pagkatapos kan mga enot na yugto nin pagproseso ipinapahiling sa Figure 2. S16. An awtomatikong plantilya nin pagpili nagigibo sa paagi nin mano-manong pagpili nin mga 250 piksel nin 1000 na partikulo sa sarong 250-piksel na frame asin mayong reperensya na duwang-dimensyonal (2D) na klasipikasyon, sa siring isinikwal an mga klasipikasyon na nakakaabot sa kontaminasyon kan sample o mayo nin mga namamansayan na karakteristiko. Dangan, an awtomatikong pagpili ginibo sa gabos na mga mikroretrato, asin an RC-LH114-W 849,359 na partikulo, asin an RC-LH116 complex 476,547 na partikulo. An gabos na piniling partikulo nag-agi nin duwang round nin non-reference 2D na klasipikasyon, asin pagkatapos kan lambang pagdalagan, an mga partikulo na nakakaabot sa lugar nin karbon, kontaminasyon kan sample, mayong malinaw na mga tampok o makusog na nag-oorog na mga partikulo an isinikwal, na nagresulta sa 772,033 (90.9%) asin 359,678 (75.5) partikulo an ginamit para sa klasipikasyon kan 3D 3D. RC-LH114-W asin RC-LH116 nin magkasunod. An enot na 3D na modelo nin reperensya ginibo gamit an stochastic gradient descent method. Gamit an enot na modelo bilang reperensya, an mga piniling partikulo pigklasipikar sa apat na kategorya sa 3D. Gamit an modelo sa kategoryang ini bilang reperensya, maggibo nin 3D na pagdalisay sa mga partikulo sa pinakadakulang kategorya, dangan gamiton an enot na 15Å low-pass filter tanganing takpan an lugar kan solvent, magdagdag nin 6 na piksel nin mga malumoy na gilid, asin i-post-proseso an mga piksel tanganing itama an Gatan K2 peak Modulation transfer function kan top detector. Para sa RC-LH114-W dataset, an enot na modelong ini pigbago sa paagi nin paghale kan makusog na densidad sa mga gilid kan maskara (na nadiskonekta sa core complex density sa UCSF Chimera). An mga nagresultang modelo (an mga resolusyon kan RC-LH114-W asin RC-LH116 iyo an 3.91 asin 4.16 Å, sunod-sunod) ginagamit bilang reperensya para sa ikaduwang hugna kan 3D na klasipikasyon. An mga partikulo na ginamit pinaggrupo sa enot na klase nin 3D asin mayo nin makusog na korelasyon sa pagtaraid. Pag-overlap o kawaran nin malinaw na mga tampok sa estruktura. Pagkatapos kan ikaduwang hugna kan 3D na klasipikasyon, an kategorya na may pinakahalangkaw na resolusyon an pinili [Para sa RC-LH114-W, an sarong kategorya iyo an 377,703 na partikulo (44.5%), para sa RC-LH116, igwa nin duwang kategorya, na nagkakantidad nin 260,752 na partikulo (54.7% Wh%), kun sinda pareho sana an nakalinya pagkatapos. enot na pagbirik na may sadit na pagkakaiba]. An mga piniling partikulo pigkukua giraray sa sarong 400-pixel na kahon asin pigpipino sa paagi nin 3D na pagdalisay. An solvent mask ginigibo gamit an enot na 15Å low-pass filter, 3 pixel map expansion asin 3 pixel soft mask. Gamit an per-particle CTF refinement, per-particle motion correction asin an ikaduwang hugna kan per-particle CTF refinement, an 3D refinement, solvent masking asin post-processing ginigibo pagkatapos kan lambang lakdang tanganing orog pang mapino an nagreresultang texture. Gamit an FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) cut-off value na 0.143, an mga resolusyon kan pinal na mga modelo kan RC-LH114-W asin RC-LH116 iyo an 2.65 asin 2.80Å, sunod-sunod. An kurba kan FSC kan huring modelo ipinapahiling sa Pigura 2. S17.
An gabos na mga pagkasunod-sunod nin protina pig-download gikan sa UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). An SWISS-MODEL (45) ginamit sa paggibo nin sarong modelo nin homolohiya kan RC, na igwa kan mga pagkasunod-sunod kan protina kan RC-L, RC-M asin RC-H asin an estrukturang kristal kan Rba. an sphaeroides RC ginamit bilang sarong plantilya (PDB ID: 5LSE) (46). Gamiton an “fit map” na kasangkapan sa UCSF Chimera tanganing i-fit an nagigibo na modelo sa mapa (47), mapakarhay an estruktura kan protina, asin cofactor [4×BChl a (monomer library residue name = BCL), 2×BPh a (BPH), saro o duwang klase nin UQ10 (U10), sarong non-heme iron (Fe) asin 34-hexadichodicoline (QAK)] gamiton an Coot (48) sa pagdagdag. Nin huli ta an QAK dai makukua sa libreriya nin monomer, ini pigparameterize gamit an eLBOW tool sa PHENIX (49).
Sunod, an LH1 subunit pigkonstruhir. Sa primero, an automatikong kasangkapan sa pagtogdok sa PHENIX (49) ginamit tanganing awtomatikong magtogdok nin parte kan LH1 na pagkasunod-sunod gamit an mapa asin an LH1-α asin LH1-β na mga pagkasunod-sunod kan protina bilang input. Pilion an pinakakumpletong LH1 subunit, kuanon ini asin ikarga ini sa Coot, mano-manong idagdag an nawawarang pagkasunod-sunod digdi, asin mano-manong pinoon an bilog na estruktura bago magdagdag nin duwang BCls a (BCL) asin sarong spirilloxanthin (CRT) [susog sa nanonongdan na Rps An densidad kan LH1 complex asin an aram na laog kan carotenoid. Species (17)]. Kopyahon an kumpletong LH1 subunit, asin gamiton an UCSF Chimera “Docking Map Tool” tanganing mag-dock sa kataid na bakong modelo na lugar kan densidad kan LH1, dangan pinoon ini sa Coot; otrohon an proseso sagkod na an gabos na LH1 subunits namodelo na. Para sa estruktura kan RC-LH114-W, sa paagi nin pagkua kan dai nakaalokar na densidad sa Coot, an protina pigsegment gikan sa natatadang mga bakong protina na mga sangkap sa USCF Chimera map asin an Autobuild tool ginagamit sa pag-establisar kan enot na modelo, asin an natatadang mga subunit (protein-W) Modeling. Sa PHENIX (49). Idagdag an anuman na nawawarang mga pagkasunod-sunod sa nagresultang modelo sa Coot (48), dangan mano-manong pinoon an bilog na subunit. An natatadang dai na-alokar na densidad angay sa kombinasyon kan mga lipid (PDB monomer library ID kan CDL = CDL, POPC = 6PL asin POPG = PGT), β-DDM detergent (LMT) asin UQ10 na mga molekula (U10). Gamiton an PHENIX optimization (49) asin manual optimization sa Coot (48) tanganing maperpekto an kumpletong enot na modelo sagkod na an estadistika kan modelo asin an biswal na kalidad kan pagkakaangay dai na mapakarhay pa. Sa katapustapusi, gamiton an LocScale (50) tanganing pataromon an lokal na mapa, dangan maggibo nin nagkapirang iba pang mga siklo nin pagmodelo kan dai itinagama na densidad asin awtomatiko asin manwal na pag-optimize.
An mga kanya-kanyang peptide, cofactors asin iba pang mga lipid asin quinones na nakaduong sa laog kan saindang kanya-kanyang densidad ipinapahiling sa mga Pigura 1 asin 2. S18 sagkod S23. An estadistikal na impormasyon kan pinal na modelo ipinapahiling sa Table S1.
Apwera kun iba an sinasabi, an UV/Vis/NIR absorption spectra tinipon sa sarong Cary60 spectrophotometer (Agilent, USA) sa 1 nm na mga agwat poon 250 nm sagkod 1000 nm asin sarong oras nin pag-integrar na 0.1s.
Lasaw an sample sa sarong quartz cuvette na may 2 mm na agihan pasiring sa A880 nin 1, asin kolektahon an absorption spectrum sa pag-ultanan kan 400 asin 1000 nm. An mga pabilog na dichroic spectra tinipon sa sarong Jasco 810 spectropolarimeter (Jasco, Japan) sa 1 nm na mga agwat sa pag-ultanan kan 400 nm asin 950 nm sa sarong scan rate na 20 nm min-1.
An molar extinction coefficient nadedeterminaran sa paagi nin pagtunaw kan core complex sa sarong A880 na mga 50. Paglasaw kan 10μl na volume sa 990μl na binding buffer o methanol, asin kolektahon tulos an absorption spectrum tanganing maibanan an BChl degradation. An laog kan BChl kan lambang sample nin methanol kinarkulo sa paagi kan koepisyent nin pagkapuho sa 771 nm kan 54.8 mM-1 cm-1, asin an koepisyent nin pagkapuho nadeterminaran (51). Bangaon an sinusukol na konsentrasyon kan BChl sa 32 (RC-LH114-W) o 36 (RC-LH116) tanganing madeterminaran an konsentrasyon kan core complex, na dangan ginagamit tanganing madeterminaran an absorption spectrum kan parehong sample na nakolekta sa buffer Extinction coefficient. kahilera. Tolong paorootrong pagsukol an ginibo para sa lambang sample, asin an average na absorbance kan BChl Qy maximum ginamit para sa pagkalkulo. An koepisyent nin pagkapuho kan RC-LH114-W na sinusukol sa 878 nm iyo an 3280±140 mM-1 cm-1, mantang an koepisyent nin pagkapuho kan RC-LH116 na sinusukol sa 880 nm iyo an 3800±30 mM-1 cm-1.
An UQ10 pig-quantify susog sa paagi sa (52). Sa halipot na pagtaram, an reverse phase HPLC (RP-HPLC) ginibo gamit an Agilent 1200 HPLC system. Tunawon an mga 0.02 nmol kan RC-LH116 o RC-LH114-W sa 50μl kan 50:50 methanol:chloroform na igwa nin 0.02% (w/v) ferric chloride, asin i-ineksion an pre-equilibrated Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4 mml Tunawon sa 1-1-1-m. 40°C sa HPLC solvent (80:20 methanol:2-propanol) sa sarong ×25 cm na haligi. Maggibo nin isocratic elution sa sarong HPLC solvent tanganing ma-monitor an absorbance sa 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoids) asin 780 nm (BChl) sa laog nin 1 oras. An peak sa 275 nm chromatogram sa 25.5 minutos pinagsararo, na mayo nin ibang mga nahihiling na mga compound. An pinagsararong lugar ginagamit sa pagkwenta kan molar na kantidad kan UQ10 na nakua na may pagsambit sa kurba nin kalibrasyon na kinakalkulo gikan sa pag-ineksiyon nin purong mga pamantayan poon 0 sagkod 5.8 nmol (Figure S14). An lambang sample pig-analisar sa tolong replika, asin an ibinareta na sala katumbas kan SD kan average.
An solusyon na igwa kan RC-LH1 complex na may pinakahalangkaw na Qy absorption na 0.1 pigpreparar na may 30 μM na nabawasan na horse heart cytochrome c2 (Merck, UK) asin 0 sagkod 50 μMUQ2 (Merck, UK). Tolong 1-ml na sample an pigpreparar sa lambang konsentrasyon kan UQ2 asin pig-inkubar sa bilog na banggi sa diklom sa 4°C tanganing maseguro an kumpletong pag-adaptar sa diklom bago an pagsukol. An solusyon pigkarga sa sarong OLIS RSM1000 modular spectrophotometer na igwa nin 300 nm flame/500 line grating, 1.24 mm inlet, 0.12 mm middle asin 0.6 mm outlet slits. An 600 nm na halawig na pass filter ibinubugtak sa entrada kan sample phototube asin an reference photomultiplier tube tanganing dai iiba an liwanag nin pagpukaw. An absorbance pig-monitor sa 550 nm na may oras nin pag-integrar na 0.15 s. An liwanag nin pagpukaw ipinaluwas gikan sa 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) sa paagi nin sarong fiber optic cable sa 90% na intensidad sa paagi nin sarong DC2200 controller (Thorlabs Ltd., UK) asin ipinaluwas sa pinagkukuanan nin liwanag sa anggulo na 90°. An sinag nin pagsukol nakatumang sa salming tanganing ibalik an anuman na liwanag na dai enot na nasupsop kan sampol. Bantayan an absorbance 10 s bago an pag-ilaw nin 50 s. Dangan an absorbance orog pang pig-monitor sa laog nin 60 s sa diklom tanganing masuri kun sagkod saen an quinolol kusang nagbabawas kan cytochrome c23 + (hilingon an Figure S8 para sa hilaw na datos).
An datos pigproseso sa paagi nin pag-fit nin linear initial rate sa laog nin 0.5 sagkod 10 s (depende sa konsentrasyon kan UQ2) asin pag-average kan mga rate kan gabos na tolong sample sa lambang konsentrasyon kan UQ2. An konsentrasyon kan RC-LH1 na kinakalkulo kan kanya-kanyang koepisyent nin pagkapuho ginamit tanganing i-convert an rate sa catalytic efficiency, na pig-plot sa Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), asin pig-fit sa Michaelis-Menten model tanganing madeterminaran an mga malinaw na halaga kan Km asin Kcat.
Para sa mga pagsukol kan transient absorption, an sample kan RC-LH1 piglasaw sa ~2μM sa IMAC buffer na igwa nin 50 mM sodium ascorbate (Merck, USA) asin 0.4 mM Terbutin (Merck, USA). An ascorbic acid ginagamit bilang sarong sakripisyo na electron donor, asin an tert-butaclofen ginagamit bilang sarong QB inhibitor tanganing maseguro na an mayor na RC donor nagdadanay na nabawasan (an boot sabihon, bakong photooxidized) sa bilog na proseso nin pagsukol. Mga 3 ml nin sample an idinadagdag sa sarong pasadyang nag-iikot na selula (mga 0.1 m an diametro, 350 RPM) na may 2 mm na laba kan optical path tanganing maseguro na an sample sa laser path igwa nin igong panahon para sa madiklom na adaptasyon sa pag-ultanan kan mga pulso nin pagpukaw. Gamiton an ~100-fs laser pulses tanganing mapakusog an Ti: Sapphire laser system (Spectra Physics, USA) tanganing ma-excite an sample sa 880 nm sa repetition rate na 1 kHz (20 nJ para sa NIR o 100 nJ para sa Vis). Bago magkolekta nin datos, ibugtak an sample sa liwanag nin pagpukaw sa laog nin mga 30 minutos. An pagkakalantad magigin dahelan nin pag-inaktibo kan QA (posibleng pagbawas kan QA nin sarong beses o duwang beses). Alagad tandaan na an prosesong ini pwedeng baliktadon huli ta pagkatapos nin halawig na panahon nin madiklom na pag-adaptar, an RC luway-luway na mabalik sa aktibidad kan QA. Sarong Helios spectrometer (Ultrafast Systems, USA) an ginamit sa pagsukol kan mga transient spectra na may delay time na -10 sagkod 7000 ps. Gamiton an Surface Xplorer software (Ultrafast Systems, USA) tanganing i-ungroup an mga data set, dangan i-merge asin i-standardize. Gamiton an CarpetView software package (Light Conversion Ltd., Lithuania) tanganing gamiton an pinagsararong datos na set tanganing makakua nin mga differential spectra na may relasyon sa pagkabulok, o gamiton an sarong function na nagkokonvolve nin dakol na mga exponent na may instrumentong simbag tanganing magkaigo sa single-wavelength spectral evolution sa Origin (OriginLab, USA).
Siring sa nasambit sa itaas (53), sarong photosynthetic film na igwa nin LH1 complex na kulang sa parehong RC asin peripheral LH2 antenna an pig-andam. An lamad piglasaw sa 20 mM tris (pH 8.0) dangan pigkarga sa sarong quartz cuvette na may 2 mm na optical path. Sarong 30nJ laser pulse an ginamit tanganing ma-excite an sample sa 540 nm na may delay time na -10 sagkod 7000 ps. Iproseso an set nin datos siring sa ipinapaliwanag para sa Rps. pal sample.
An lamad pig-pellet sa paagi nin centrifugation sa 150,000 RCF sa laog nin 2 oras sa 4°C, dangan an absorbance kaini sa 880 nm pig-resuspend sa 20 mM tris-HCl (pH 8.0) asin 200 mM NaCl. Tunawon an lamad sa paagi nin luway-luway na paghalo sa 2% (w/v) β-DDM sa laog nin 1 oras sa diklom sa 4°C. An sample piglasaw sa 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) sa konsentrasyon nin protina na 2.5 mg ml-1 (Bio-Rad analysis). An dugang pang pagproseso ginibo gikan sa dati nang ipinublikar na paagi (54), na nagpoon sa pagtunaw kan 50 μg na protina sa total na 50 μl TEAB na igwa nin 1% (w/v) sodium laurate (Merck, UK). Pagkatapos kan sonication sa laog nin 60 s, ini pigbaba sa 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (Merck, UK) sa 37°C sa laog nin 30 minutos. Para sa S-alkylation, i-inkubar an sample sa 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) asin idagdag ini gikan sa 200 mM isopropanol stock solution sa laog nin 10 minutos sa temperatura kan kwarto. An proteolytic digestion ginibo sa paagi nin pagdagdag nin 2 μg trypsin/endoproteinase Lys-C mixture (Promega UK) asin pig-inkubar sa 37°C sa laog nin 3 oras. An laurate surfactant kinua sa paagi nin pagdagdag nin 50 μl ethyl acetate asin 10 μl 10% (v/v) LC grade trifluoroacetic acid (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) asin pag-vortexing sa laog nin 60 s. An pagbubulag kan yugto pig-promote sa paagi nin sentrifugasyon sa 15,700 RCF sa laog nin 5 minutos. Susog sa protocol kan paragibo, sarong C18 spin column (Thermo Fisher Scientific, UK) an ginamit tanganing maingat na mag-aspirate asin mag-desalt kan mas hababang yugto na igwa kan peptide. Pagkatapos na mamara sa paagi nin vacuum centrifugation, an sample tinunaw sa 0.5% TFA asin 3% acetonitrile, asin 500 ng inaanalisar sa paagi nin nanoflow RP chromatography na may kaibang mass spectrometry gamit an mga parametro kan sistema na detalyado kaidto.
Gamiton an MaxQuant v.1.5.3.30 (56) para sa pagmidbid asin pagkwantipika kan protina tanganing hanapon an Rps. palustris proteome database (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). An datos kan mass spectrometry proteomics nadeposito sa ProteomeXchange Alliance sa paagi kan PRIDE partner repository (http://proteomecentral.proteomexchange.org) sa irarom kan dataset identifier PXD020402.
Para sa pag-analisar sa paagi nin RPLC na may kaibang electrospray ionization mass spectrometry, an RC-LH1 complex pigpreparar gikan sa wild-type Rps. Gamit an dati nang ipinublikar na paagi (16), an konsentrasyon nin protina na nagigibo sa mga selula nin palustris iyo an 2 mg ml-1 sa 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl asin 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad analysis) ) DDM. Susog sa protocol kan paragibo, gamiton an 2D purification kit (GE Healthcare, USA) tanganing magkua nin 10 μg na protina sa paagi nin pag-uran, asin tunawon an precipitate sa 20 μl 60% (v / v) formic acid (FA), 20% (v / v) Acetonitrile asin 20% (v/v) tubig. Limang mikrolitro an pig-analisar sa paagi kan RPLC (Dionex RSLC) na may kaibang mass spectrometry (Maxis UHR-TOF, Bruker). Gamiton an MabPac 1.2×100 mm na haligi (Thermo Fisher Scientific, UK) para sa pagbubulag sa 60°C asin 100μlmin -1, na may gradient na 85% (v / v) na solvent A [0.1% (v / v) FA asin 0.02% (V/v) TFA aqueous solution] sa 5% (v / v) na solvent [0.1%(v/v) FA asin 0.02%(v/v) sa 90%(v/v) acetonitrile TFA] Gamit an standard na electrospray ionization source asin default na mga parametro sa laog nin labing 60 minutos, an mass spectrometer nakakakua nin 100 sagkod 2750 m/z (mass-ratio-charge). Sa tabang kan ExPASy bioinformatics resource portal FindPept tool (https://web.expasy.org/findpept/), i-mapa an mass spectrum sa mga subunit kan complex.
An mga selula pinadakula sa laog nin 72 oras sa irarom nin 100 ml NF-low (10μMm-2 s-1), medium (30μMm-2 s-1) o high (300μMm-2 s-1) na liwanag. M22 medium (M22 medium na kun saen an ammonium sulfate dai kabali asin an sodium succinate sinalidahan nin sodium acetate) sa sarong 100 ml na screw-top na bote (23). Sa limang 30-s na siklo, an 0.1 micron na mga kuwintas na salming pig-bead sa volume ratio na 1:1 tanganing ma-lyse an mga selula asin pinalipot sa yelo sa laog nin 5 minutos. An dai natutunaw na bagay, mga dai nabari na selula asin mga kuwintas na salming hinale sa paagi nin sentrifugasyon sa 16,000 RCF sa laog nin 10 minutos sa sarong benchtop microcentrifuge. An lamad pinagsuhay sa sarong Ti 70.1 rotor na may 100,000 RCF sa 20 mM tris-HCl (pH 8.0) na may 40/15% (w/w) sucrose gradient sa laog nin 10 oras.
Siring sa ipinaliwanag sa samong nakaaging trabaho, an immunodetection kan His tag sa PufW (16). Sa halipot na pagtaram, an pinadalisay na core complex (11.8 nM) o an lamad na igwa nin parehong konsentrasyon nin RC (na nadeterminaran sa paagi nin oksidasyon na pigbabawas an nabawasan na pagkakaiba kan spectrum asin pigtutugma an karga sa tinina na gel) sa 2x SDS loading buffer (Merck, UK) na piglasaw nin duwang beses. An mga protina pinagsuhay sa sarong replika 12% bis-tris NuPage gel (Thermo Fisher Scientific, UK). Sarong gel an tinina nin Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) tanganing i-load asin ma-visualize an RC-L subunit. An protina sa ikaduwang gel ibinalyo sa methanol-activated polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Thermo Fisher Scientific, UK) para sa immunoassay. An PVDF membrane pig-block sa 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 asin 5% (w / v) skimmed milk powder, dangan pig-inkubar sa anti-His primary antibody (sa Dilute the antibody buffer [50 mM-HCl 7.6), 150 mM NaCl asin 0.05% (v/v) Tween-20] sa 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) sa laog nin 4 na oras. Pagkatapos na maghugas nin 3 beses sa laog nin 5 minutos sa antibody buffer, an lamad pinagsararo sa horseradish peroxidase (Sigma-Aldrich, UK) anti-mouse secondary antibody (pinatunaw nin 1:10,000 sa antibody buffer) I-inkubar tanganing tugutan an pagdetektar (5 minutos pagkatapos nin 3 paghugas sa antibody buffer) gamit an WAR EST 2000. chemiluminescence substrate (Cyanagen, Italya) asin Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Sa paagi nin pagdrowing kan distribusyon kan intensidad kan lambang tinina na gel o immunoassay lane, pag-integrar kan lugar sa irarom kan peak asin pagkalkulo kan intensidad na ratio kan RC-L (tinadong gel) asin Protein-W (immunoassay), sa ImageJ (57) Iproseso an imahe. An mga ratio na ini pigkombertir sa mga molar ratio sa paagi nin pag-asang an ratio kan RC-L sa protina-W sa purong sample kan RC-LH114-W 1:1 asin pig-normalize an bilog na set nin datos susog diyan.
Para sa mga dagdag na materyales para sa artikulong ini, hilingon an http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Ini sarong open access na artikulo na ipinapanao sa irarom kan mga termino kan Creative Commons Attribution License. An artikulo nagtutugot nin daing limitasyon na paggamit, distribusyon, asin reproduksyon sa arin man na paagi sa irarom kan kondisyon na an orihinal na obra tamang sinitar.
Tandaan: Hinahagad mi sana saimo na itao mo an saimong email address tanganing maaraman kan tawong saimong irinerekomendar sa page na gusto mong mahiling ninda an email asin na bako ining spam. Dai kami makakakua nin anuman na mga email address.
An hapot na ini ginagamit tanganing maprobaran kun ika sarong bisita asin maibitaran an awtomatikong pagsusumite nin spam.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Hicoil Necoil Necoilter.
An halangkaw an resolusyon na estruktura kan light trap 1 complex sa sentro nin reaksyon nagtatao nin bagong mga pananaw sa dinamika kan quinone.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Hicoil Necoil Necoilter.
An halangkaw an resolusyon na estruktura kan light trap 1 complex sa sentro nin reaksyon nagtatao nin bagong mga pananaw sa dinamika kan quinone.
©2021 American Association for the Advancement of Science. gabos na deretso reserbado. An AAAS sarong partner kan HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef asin COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.