Present *Current address: Cologne 50931, Germany, Cologne Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-related Diseases (CECAD).
An neurodegeneration kan mga helang sa mitochondria pigkokonsiderar na dai na mababawi huli ta an metabolikong plasticity kan mga neuron limitado, alagad an epekto kan mitochondrial dysfunction sa autonomiya kan selula kan metabolismo kan neuron sa hawak dai gayong nasasabotan. Digdi, ipinamidbid niamo an proteome na espesipiko sa selula kan mga neuron kan Purkinje na may progresibong kakulangan sa OXPHOS na kawsa kan nadisturbo na dinamika kan pagsasaro kan mitochondrial. Nanompongan niamo na an mitochondrial dysfunction nagpukaw nin sarong hararom na pagbabago sa larangan nin proteomics, na sa kahurihurihi nagdara sa sunod-sunod na pag-aktibo kan eksaktong mga programa sa metabolismo bago an pagkagadan kan selula. Sa dai linalaoman, nadeterminaran niamo an malinaw na induksyon kan pyruvate carboxylase (PCx) asin iba pang peroxidases na may relasyon sa pagdagdag kan mga intermediate kan siklo kan TCA. An pagpugol kan PCx nagpagrabe kan oxidative stress asin neurodegeneration, na nagpapahiling na an atherosclerosis igwa nin protektibong epekto sa mga neuron na kulang sa OXPHOS. An pagbalik kan pagsasaro kan mitochondrial sa mga neuron na terminally degenerated biyong binabaliktad an mga metabolikong karakteristikong ini, sa siring nakakalikay sa pagkagadan kan selula. An samong mga nadiskubre nagtutukdo nin mga dating dai pa aram na mga agihan na nagtatao nin resilience sa mitochondrial dysfunction asin nagpapahiling na an neurodegeneration pwedeng mabaliktad dawa sa mga huring yugto kan helang.
An sentral na papel kan mitochondria sa pagmantenir kan metabolismo kan enerhiya kan neuron pigduduon kan mahiwas na mga sintomas sa neurological na may koneksyon sa mga helang sa mitochondria nin tawo. Kadaklan sa mga helang na ini dara kan mga mutasyon kan gene na nagreregular kan ekspresyon kan gene kan mitochondria (1, 2) o pagkaraot kan gene na may relasyon sa dinamika kan mitochondria, na bakong direktang nakakaapektar sa estabilidad kan DNA kan mitochondria (mtDNA) (3, 4). An trabaho sa mga modelo nin hayop nagpahiling na bilang simbag sa mitochondrial dysfunction sa nakapalibot na mga tisyu, an mga konserbatibong metabolikong agihan (5-7) pwedeng ma-aktibo, kaya nagtatao nin importanteng mga pananaw sa pathogenesis kan mga komplikadong helang na ini. Sa kabaliktaran, an satong pakasabot sa mga pagbabago sa metabolismo kan mga partikular na klase nin selula na kawsa kan pankagabsan na pagkabigo kan produksyon kan mitochondrial adenosine triphosphate (ATP) sa hutok iyo an pundamental (8), na nagduduon kan pangangaipo na mamidbid an mga target na terapyutik na pwedeng gamiton tanganing maibitaran o maibitaran an helang. Ibitaran an neurodegeneration (9). An kakulangan nin impormasyon iyo an bagay na an mga selula nin nerbiyos lakop na pigkokonsiderar na igwa nin limitadong marhay na metabolikong pagkamapag-ayon kumpara sa mga klase nin selula kan nakapalibot na mga tisyu (10). Huli ta an mga selula na ini igwa nin sentral na papel sa pagkoordinar kan suplay nin mga metabolite sa mga neuron tanganing maipalakop an synaptic transmission asin magresponde sa mga kondisyon nin danyos asin helang, an kakayahan na i-adaptar an metabolismo kan selula sa mga masakit na kondisyon kan tisyu kan hutok haros limitado sa mga selula nin glial (11-14). Dugang pa, an inherent cellular heterogeneity kan tisyu kan hutok sa kadaklan nakakaulang sa pag-aadal kan mga pagbabago sa metabolismo na nangyayari sa mga partikular na subgrupo nin neuron. Bilang resulta, dikit an aram manungod sa eksaktong selula asin metabolikong mga resulta kan mitochondrial dysfunction sa mga neuron.
Tanganing masabutan an mga metabolikong resulta kan mitochondrial dysfunction, pig-isolate niamo an mga Purkinje neurons (PNs) sa manlaen-laen na yugto kan neurodegeneration na kawsa kan pagkaraot kan mitochondrial outer membrane fusion (Mfn2). Dawa ngani an mga mutasyon kan Mfn2 sa mga tawo konektado sa sarong klase nin hereditary motor sensory neuropathy na midbid bilang Charcot-Marie-Tooth type 2A (15), an kondisyonal na pagkaraot kan Mfn2 sa mga ilaga sarong midbid na marhay na induksyon kan oxidation Phosphorylation (OXPHOS) na paagi nin dysfunction. An manlaen-laen na subtype nin neuron (16-19) asin an nagreresultang neurodegenerative phenotype may kaibang mga progresibong sintomas sa neurological, arog kan mga diperensya sa paghiro (18, 19) o cerebellar ataxia (16). Sa paggamit nin kombinasyon nin label-free quantitative (LFQ) proteomics, metabolomics, imaging, asin virological na mga paagi, ipinapahiling niamo na an progresibong neurodegeneration makusog na nag-iinduce nin pyruvate carboxylase (PCx) asin iba pang mga bagay na imbuelto sa arteriosclerosis kan PNs sa vivo An ekspresyon kan mga enzyme. Tanganing ma-verify an pagkakaangay kan nakuang ini, partikularmenteng pig-down-regulate niamo an ekspresyon kan PCx sa Mfn2-deficient PNs, asin nanompongan na an operasyon na ini nagpagrabe kan oxidative stress asin nagparikas kan neurodegeneration, kaya nagpapatunay na an azoospermia nagtatao nin cell death Metabolic adaptability. An grabeng ekspresyon kan MFN2 puedeng lubos na makaligtas sa terminal degeneration PN na may grabeng kakulangan nin OXPHOS, dakulang pagkonsumo nin mitochondrial DNA, asin garo baga putol na mitochondrial network, na orog pang nagduduon na an pormang ini nin neurodegeneration puedeng makabawi pa ngani sa advanced na yugto kan helang bago magadan an selula.
Tanganing mahiling an mitochondria sa Mfn2 knockout PNs, naggamit kami nin sarong strain nin mouse na nagtutugot sa Cre-dependent mitochondria na mag-target kan yellow fluorescent protein (YFP) (mtYFP) (20) Cre expression asin pig-tsek an morpolohiya kan mitochondria sa vivo. Nanompongan niamo na an pagkaraot kan Mfn2 gene sa PNs magbubunga nin luway-luway na pagbaranga kan mitochondrial network (Figure S1A), asin an pinakaenot na pagbabago nakua sa 3 semana nin edad. Sa kabaliktaran, an substansyal na pagkaraot kan PN cell layer, siring sa ipinapahiling kan pagkawara kan Calbindin immunostaining, dai nagpoon sagkod sa 12 na semana nin edad (Figure 1, A asin B). An dai pagkakapareho kan oras sa pag-ultanan kan pinakaenot na mga pagbabago sa morpolohiya kan mitochondrial asin an nahihiling na pagpoon kan kagadanan kan neuron nagtulod sa samo na mag-imbestigar kan mga pagbabago sa metabolismo na pinukaw kan disfunction kan mitochondrial bago an pagkagadan kan selula. Nagmukna kami nin sarong estratehiya na nakabase sa fluorescence-activated cell sorting (FACS) tanganing i-isolate an YFP (YFP+)-expressing PN (Figure 1C), asin sa mga kontrol na ilaga (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), na sa huri inaapod na CTRL (Figure SBRL). An pag-optimize kan estratehiya sa pag-gate base sa relatibong intensidad kan signal kan YFP nagtutugot sato na linigon an YFP+ na hawak (YFPhigh) kan mga PN gikan sa mga bakong PN (YFPneg) (Figure S1B) o mga putative fluorescent axon/dendritic fragments (YFPlow; Figure S1D, wala), na kinumpirmar kan confocal microscope (Figure S1D, tuo). Tanganing ma-verify an pagkakakilanlan kan pigklasipikar na populasyon, nagkondusir kami nin LFQ proteomics asin dangan pag-analisar kan prinsipal na sangkap, asin nanompongan na igwa nin malinaw na pagbubulag sa pag-ultanan kan YFPhigh asin YFPneg na mga selula (Figure S1C). An mga selula nin YFPhigh nagpahiling nin net enrichment kan mga midbid na PNs markers (ie Calb1, Pcp2, Grid2 asin Itpr3) (21, 22), alagad mayo nin enrichment kan mga protina na komun na ipinapahayag sa mga neuron o iba pang klase nin selula (Figure 1D) ). An pagkumpara sa pag-oltanan kan mga sampol sa mga klasipikado na YFPhigh na mga selula na nakolekta sa mga independienteng eksperimento nagpahiling nin sarong koepisyent nin korelasyon> 0.9, na nagpapahiling nin marhay na reproducibility sa pag-oltanan kan mga biyolohikal na replika (Figure S1E). Sa sumaryo, an mga datos na ini nag-validate kan samong plano para sa acute asin specific na pag-isolate kan posibleng PN. Huli ta an L7-cre driver system na ginamit nag-iinduce nin mosaic recombination sa enot na semana pagkatapos kan pangangaki (23), nagpoon kaming mag-culling nin mga ilaga gikan sa CTRL asin conditional (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Magkolekta nin mga neuron. Pagkatapos na matapos an rekombinasyon, inaapod ining Mfn2cKO sa edad na 4 na semana. Bilang an katapusan na punto, pinili niamo an 8 semana nin edad kan an PN layer bilog pa sa ibong kan mga malinaw na mga fragmento kan mitochondrial (Figure 1B asin Figure S1A). Sa kabilugan, pig-quantify niamo an total na 3013 na protina, na mga 22% kaini nakabasar sa mga anotasyon kan MitoCarta 2.0 base sa mitochondrial proteome bilang mitochondria (Figure 1E) (Figure 1E) (24). An differential gene expression analysis na ginibo sa semana 8 nagpahiling na 10.5% sana kan gabos na protina an igwa nin mga mahalagang pagbabago (Figure 1F asin Figure S1F), na kun saen 195 na protina an na-down-regulate asin 120 na protina an na-up-regulate (Figure 1F). Mahalagang mangnohon na an "makabagong pag-analisar kan agihan" kan set na ini nin datos nagpapahiling na an mga gene na ipinapahayag sa pagkakaiba-iba mayormenteng kabali sa sarong limitadong set nin mga partikular na metabolikong agihan (Figure 1G). Interesante, dawa ngani an down-regulation kan mga agihan na may relasyon sa OXPHOS asin calcium signaling nagkukumpirma kan induksyon kan mitochondrial dysfunction sa fusion-deficient PNs, an ibang mga kategorya na mayormenteng imbuelto an metabolismo nin amino acid signipikanteng na-up-regulate, na nakalinya sa metabolismo na nangyayari sa mitochondrial PNs. An pag-rewire padagos. pagkawara nin pagpunsyon.
(A) Mga representanteng confocal na retrato kan mga seksyon kan cerebellar kan CTRL asin Mfn2cKO na mga ilaga na nagpapahiling nin progresibong pagkawara kan mga PN (calbindin, abohon); an mga nukleo pigkontra sa DAPI. (B) Pagkwantipika kan (A) (sarong-paagi na pag-analisar kan pagkakaiba, ***P<0.001; n = 4 sagkod 6 na mga bilog gikan sa tolong ilaga). (C) Eksperimental na dalagan nin trabaho. (D) Distribusyon kan heat map kan mga marker na espesipiko sa Purkinje (itaas) asin iba pang klase nin selula (tahaw). (E) Venn diagram na nagpapahiling kan bilang kan mga protina kan mitochondria na namidbid sa pigklasipikar na PN. (F) Plot kan bulkan kan mga protina na may pagkakaiba sa ekspresyon sa mga neuron kan Mfn2cKO sa 8 na semana (an halaga kan cut-off na kahulugan na 1.3). (G) An pag-analisar kan agihan nin pagkamapagmukna nagpapahiling kan limang pinaka-importanteng mga agihan nin up-regulation (pula) asin down-regulation (asul) sa Mfn2cKO PN na pigklasipikar bilang 8 na semana. An average na lebel nin ekspresyon kan lambang nadetektar na protina ipinapahiling. Grayscale heat map: pig-adjust na halaga kan P. ns, bakong mahalaga.
An datos kan proteomics nagpahiling na an ekspresyon kan protina kan mga komplikado I, III, asin IV luway-luway na nagbaba. An mga complex I, III, asin IV gabos igwa nin mga esensyal na mtDNA-encoded subunits, mantang an complex II, na nuclear-coded sana, sa pundamental dai naapektaran (Figure 2A asin Figure S2A). . Susog sa mga resulta kan proteomics, an immunohistochemistry kan mga seksyon kan tisyu kan cerebellar nagpahiling na an MTCO1 (mitochondrial cytochrome C oxidase subunit 1) subunit na lebel kan complex IV sa PN luway-luway na nagbaba (Figure 2B). An mtDNA-encoded subunit Mtatp8 nagin mahiwas na nabawasan (Figure S2A), mantang an steady-state level kan nuclear-encoded ATP synthase subunit nagdanay na dai nagbago, na iyo an midbid na stable ATP synthase subassembly F1 complex kun an mtDNA expression stable. An pormasyon pareho. Putulan (7). An ebalwasyon kan lebel kan mtDNA sa mga pinag-urulay na Mfn2cKO PNs sa paagi nin real-time polymerase chain reaction (qPCR) nagkumpirma kan luway-luway na pagbaba kan bilang kan kopya kan mtDNA. Kun ikukumpara sa grupong kontrol, sa edad na 8 na semana, mga 20% sana kan lebel kan mtDNA an napagdanay (Figure 2C). Susog sa mga resultang ini, an confocal microscopy staining kan Mfn2cKO PNs tanganing mahiling an DNA nagpapahiling kan oras-dependent na pagkonsumo kan mga mitochondrial nucleotides (Figure 2D). Nanompongan niamo na an nagkapirang kandidato sana na imbuelto sa pagkaraot kan protina kan mitochondria asin pagsimbag sa stress an na-up-regulate, kabali an Lonp1, Afg3l2 asin Clpx, asin mga OXPHOS complex assembly factors. Mayo nin mga mahalagang pagbabago sa lebel kan mga protina na imbuelto sa apoptosis an nadetektaran (Figure S2B). Siring man, nanompongan niamo na an mga kanal kan mitochondria asin endoplasmic reticulum na imbuelto sa transportasyon nin calcium igwa sana nin saradit na pagbabago (Figure S2C). Dugang pa, an ebalwasyon kan mga protina na may relasyon sa autophagy dai nakanompong nin mga mahalagang pagbabago, na kapareho kan nahihiling na induksyon kan mga autophagosome na naobserbaran sa vivo sa paagi nin immunohistochemistry asin electron microscopy (Figure S3). Alagad, an progresibong OXPHOS dysfunction sa PNs may kaibang malinaw na mga pagbabago sa ultrastructural mitochondrial. An mga mitochondrial clusters mahihiling sa mga hawak kan selula asin mga kahoy na dendritic kan Mfn2cKO PNs na may edad na 5 asin 8 na semana, asin an estruktura kan panlaog na lamad nag-agi nin hararom na mga pagbabago (Figure S4, A asin B). Susog sa mga pagbabagong ini sa ultrastructural asin sarong signipikanteng pagbaba sa mtDNA, an pag-analisar kan mga acute cerebral cerebellar slices na may tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) nagpahiling na an potensyal kan mitochondrial membrane sa Mfn2cKO PNs signipikanteng nagbaba (Figure S4C).
(A) Pag-analisar kan kurso nin oras kan lebel nin ekspresyon kan OXPHOS complex. Isipon sana an mga protina na may P<0.05 sa 8 na semana (two-way ANOVA). Tuldok na linya: Mayo nin pag-aayos kumpara sa CTRL. (B) Wala: Sarong halimbawa nin sarong seksyon kan cerebellar na may marka na anti-MTCO1 antibody (scale bar, 20 μm). An lugar na inookupar kan mga hawak kan selula kan Purkinje natatahoban nin dilaw. Sa too: Pagkwantipika kan mga lebel kan MTCO1 (sarong-paagi na pag-analisar kan pagkakaiba; n = 7 sagkod 20 na mga selula na pig-analisar gikan sa tolong ilaga). (C) qPCR analysis kan mtDNA copy number sa pinag-urulay na PN (one-way analysis of variance; n = 3 sagkod 7 na mga ilaga). (D) Wala: Sarong halimbawa nin sarong hiwa nin cerebellar na may marka na anti-DNA antibody (scale bar, 20 μm). An lugar na inookupar kan mga hawak kan selula kan Purkinje natatahoban nin dilaw. Tuo: Pagkwantipika kan mga lesyon kan mtDNA (sarong-paagi na pag-analisar kan pagkakaiba; n = 5 sagkod 9 na mga selula gikan sa tolong ilaga). (E) Sarong halimbawa nin sarong acute cerebellar section na nagpapahiling nin mitoYFP + Purkinje cells (pana) sa sarong whole-cell patch clamp recording. (F) Pagkwantipika kan kurba kan IV. (G) Mga representanteng rekording kan depolarizing current injection sa CTRL asin Mfn2cKO Purkinje cells. Itaas na bakas: An enot na pulso na nagpukaw kan AP. Trace sa ibaba: Pinakahalangkaw na frekuensya kan AP. (H) Pagkwantipika kan mga postsynaptic spontaneous inputs (sPSPs). An representanteng recording trace asin an zoom ratio kaini ipinapahiling sa (I). An sarong-paagi na pag-analisar kan pagkakaiba-iba nag-analisar nin n = 5 sagkod 20 na mga selula gikan sa tolong ilaga. An mga datos ipinapahayag bilang mean±SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Mga representanteng bakas kan spontaneous AP na naitala gamit an perforated patch clamp mode. Itaas na bakas: Pinakahalangkaw na frekuensya kan AP. Trace sa ibaba: pag-zoom kan sarong AP. (K) I-quantify an average asin maximum AP frequency susog sa (J). Mann-Whitney test; n = 5 na mga selula an pig-analisar gikan sa apat na ilaga. An mga datos ipinapahayag bilang mean±SEM; bakong mahalaga.
An malinaw na danyos kan OXPHOS nadetektaran sa 8-semana na Mfn2cKO PN, na nagpapahiling na an pisyolohikong pagpunsyon kan mga neuron grabeng abnormal. Kaya, inaanalisar niamo an mga pasibo na elektrikal na karakteristiko kan mga neuron na kulang sa OXPHOS sa 4 sagkod 5 na semana asin 7 sagkod 8 na semana sa paagi nin paggibo nin mga rekording kan bilog na selula na patch clamp sa mga acute cerebellar slices (Figure 2E). Sa dai linalaoman, an average na resting membrane potential asin input resistance kan Mfn2cKO neurons kapareho kan kontrol, dawa ngani igwa nin mga mahiwas na pagkakaiba sa pag-ultanan kan mga selula (Table 1). Siring man, sa edad na 4 sagkod 5 na semana, mayo nin mga mahalagang pagbabago sa relasyon kan kuryente-boltahe (IV curve) an nakua (Figure 2F). Alagad, mayo nin Mfn2cKO neurons na 7 sagkod 8 na semana an edad an nakaligtas sa IV regimen (hyperpolarization step), na nagpapahiling na igwa nin malinaw na pagkasensitibo sa potensyal nin hyperpolarization sa huring yugtong ini. Sa kabaliktaran, sa mga neuron kan Mfn2cKO, an mga depolarizing current na nagigin dahelan kan mga repetitive action potential (AP) na mga pagluwas marahay na tinotogotan, na nagpapahiling na an saindang kabilogan na mga pattern nin pagluwas bakong gayong naiiba sa mga 8-semanang kontrol na mga neuron (Table 1 asin Figure 2G). Siring man, an frekuensya asin amplitude kan spontaneous postsynaptic currents (sPSCs) kapareho kan mga kontrol na grupo, asin an frekuensya kan mga pangyayari naglangkaw poon 4 na semana sagkod 5 semana sagkod 7 semana sagkod 8 semana na may kaparehong paglangkaw (Figure 2, H asin I). An panahon kan synaptic maturation sa PNs (25). An kaparehong mga resulta nakua pagkatapos kan mga perforated PNs patch. An kumpigurasyon na ini nag-uulang sa posibleng bayad kan mga depekto sa ATP kan selula, arog kan pwedeng mangyari sa pagrekord kan bilog na selula na patch clamp. Sa partikular, an resting membrane potential asin spontaneous firing frequency kan Mfn2cKO neurons dai naapektaran (Figure 2, J asin K). Sa sumaryo, an mga resultang ini nagpapahiling na an mga PN na may malinaw na OXPHOS dysfunction nakakaya an mga high-frequency discharge patterns nin marhay, na nagpapahiling na igwa nin mekanismo nin kompensasyon na nagtutugot sainda na mamantenir an haros normal na mga simbag sa electrophysiological.
An mga datos ipinapahayag bilang mean ± SEM (one-way analysis of variance, Holm-Sidak's multiple comparison test; *P<0.05). An numero kan yunit ipinapahiling sa paagi nin mga braket.
Nagpoon kaming mag-imbestigar kun baga an arin man na kategorya sa proteomics dataset (Figure 1G) kabali an mga agihan na pwedeng magkontra sa grabeng kakulangan nin OXPHOS, sa siring nagpapaliwanag kun tano ta an apektadong PN pwedeng magmantenir nin haros normal na electrophysiology (Figure 2, E sagkod K). . An pag-analisar kan proteomics nagpahiling na an mga enzyme na imbuelto sa catabolism kan branched chain amino acids (BCAA) signipikanteng na-up-regulate (Figure 3A asin Figure S5A), asin an pinal na produkto na acetyl-CoA (CoA) o succinyl CoA pwedeng magdagdag sa mga tricarboxylates sa arteriosclerosis Acid (TCA) cycle. Nanompongan niamo na an laog kan BCAA transaminase 1 (BCAT1) asin BCAT2 parehong naglangkaw. Sinda an nag-catalyze kan enot na lakdang kan BCAA catabolism sa paagi nin paggibo nin glutamate gikan sa α-ketoglutarate (26). An gabos na subunit na minakompuesto kan branched chain keto acid dehydrogenase (BCKD) complex pig-upregulate (an complex nag-catalyze kan kasunod asin dai na mababawi na decarboxylation kan nagreresultang BCAA carbon skeleton) (Figure 3A asin Figure S5A). Alagad, mayo nin malinaw na mga pagbabago sa BCAA mismo an nakua sa pinag-urulay na PN, na pwedeng huli sa paglangkaw kan pag-ako kan selula kan mga importanteng amino acid na ini o an paggamit nin ibang mga pinagkukuanan (glucose o lactic acid) tanganing dagdagan an siklo kan TCA (Figure S5B). An mga PN na kulang sa OXPHOS nagpahiling man nin mas halangkaw na mga aktibidad sa pagkabulok kan glutamine asin transamination sa 8 na semana nin edad, na pwedeng maipahiling sa pag-up-regulate kan mga mitochondrial enzymes glutaminase (GLS) asin glutamine pyruvate transaminase 2 (GPT2) (Figure 3, A asin C). Mahalagang mangnohon na an pag-up-regulate kan GLS limitado sa spliced ​​fisoform glutaminase C (GLS-GAC) (an pagbabago kan Mfn2cKO/CTRL mga 4.5-fold, P = 0.05), asin an espesipikong pag-up-regulate kaini sa mga tisyu nin kanser Pwedeng magsuporta sa mitochondrial bioenergy. (27).
(A) An heat map nagpapahiling kan pagbabago kan lebel kan protina para sa itinalaan na ruta sa 8 na semana. (B) Halimbawa nin sarong hiwa nin cerebellar na may marka na anti-PCx antibody (scale bar, 20 μm). An dilaw na pana nagtutukdo sa hawak kan selula kan Purkinje. (C) An pag-analisar kan ekspresyon kan protina sa kurso nin panahon na namidbid bilang sarong importanteng kandidato para sa atherosclerosis (multiple t-test, *FDR <5%; n = 3-5 na mga ilaga). (D) Sa itaas: Sarong eskematikong diagram na nagpapahiling kan manlaen-laen na paagi nin paglaog sa may marka na karbon na yaon sa [1-13C]pyruvate tracer (ie, sa paagi nin PDH o trans-arterial na ruta). Ibaba: An tsart kan violin nagpapahiling kan porsyento kan single-labeled carbon (M1) na nakombertir sa aspartic acid, citric acid asin malic acid pagkatapos na i-label an mga acute cerebellar slices na may [1-13C]pyruvate (paired t-test; ** P <0.01). (E) Komprehensibong pag-analisar kan kasaysayan kan panahon kan ipinapahiling na dalan. Isipon sana an mga protina na may P<0.05 sa 8 na semana. Putol-putol na linya: mayong halaga nin pag-aayos (duwang-paagi na pag-analisar kan pagkakaiba; * P <0.05; *** P <0.001). An mga datos ipinapahayag bilang mean±SEM.
Sa samong pag-analisar, an katabolismo kan BCAA nagin saro sa mga pangenot na agihan nin pag-up-regulate. An bagay na ini makusog na nagsusuherir na an volume kan bentilasyon na naglalaog sa siklo kan TCA pwedeng mabago sa PN na kulang sa OXPHOS. Ini pwedeng magrepresentar nin sarong mayor na porma nin neuronal metabolic rewiring, na pwedeng magkaigwa nin direktang epekto sa neuronal physiology asin survival sa panahon kan pagmantenir kan grabeng OXPHOS dysfunction. Susog sa hipotesis na ini, nanompongan niamo na an mayor na anti-atherosclerotic enzyme PCx na-up-regulate (Mfn2cKO/CTRL nagbabago nin mga 1.5 beses; Pigura 3A), na nag-catalyze kan pagkombertir kan pyruvate pasiring sa oxaloacetate (28), na pigtutubodan na sa brainsutes an ekspresyon nin astrocyte limitado sa (29, 30). Susog sa mga resulta kan proteomics, an confocal microscopy nagpahiling na an ekspresyon kan PCx partikularmente asin signipikanteng naglangkaw sa mga PN na kulang sa OXPHOS, mantang an reaktibo kan PCx mayormenteng limitado sa mga kataid na Bergmann glial cells kan kontrol (Figure 3B). Tanganing ma-functional na ma-test an naobserbaran na upregulation kan PCx, tinawan niamo nin [1-13C]pyruvate tracer an mga acute cerebellar slices. Kan an pyruvate na-oxidize kan pyruvate dehydrogenase (PDH), an isotope label kaini nawara, Alagad ini isinabay sa mga intermediate kan siklo kan TCA kun an pyruvate na-metabolize kan mga vascular reactions (Figure 3D). Bilang suporta sa samong datos sa proteomics, naobserbaran niamo an dakulang bilang nin mga marker gikan sa tracer na ini sa aspartic acid kan mga hiwa kan Mfn2cKO, mantang an citric acid asin malic acid igwa man nin katamtaman na uso, dawa ngani bakong makahulogan (Figure 3D).
Sa mga dopamine neuron kan MitoPark na mga ilaga na may mitochondrial dysfunction na kawsa kan mga dopamine neuron na partikularmenteng nagraraot kan mitochondrial transcription factor A gene (Tfam) (Figure S6B), an ekspresyon kan PCx nagin man na-up-regulate (31), na nagpapahiling na an acetone acid arteriosclerosis An pangyayari kan helang nareregular sa panahon kan mga dysfunction kan neuron OXPHOS sa lawas. Mahalagang mangnohon na napag-araman na an mga pambihirang enzyme (32-34) na pwedeng maipahayag sa mga neuron na pwedeng may koneksyon sa arteriosclerosis iyo an makahulogan na na-up-regulate sa mga PN na kulang sa OXPHOS, arog kan propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), an Malonyl-CoA nagkokombertir kan propionyl-CoA sa propionyl-CoA asin malichondrial mitocondrial enzyme 3 (ME3), na an mayor na papel iyo an pagbawi kan pyruvate gikan sa malate (Figure 3, A asin C) (33, 35). Dugang pa, nakua niamo an sarong mahalagang paglangkaw sa Pdk3 enzyme, na nag-phosphorylate asin kun siring nag-i-inactivate kan PDH (36), mantang mayo nin mga pagbabago na nadetektar sa Pdp1 enzyme na nag-aaktibo kan PDH o sa PDH enzyme complex mismo (Figure 3A). Sa padagos, sa Mern2cKO PNs, an phosphorylation kan α1 subunit α (PDHE1α) subunit kan pyruvate dehydrogenase E1 na sangkap kan PDH complex sa Ser293 (midbid na nag-iingat kan aktibidad kan enzyme kan PDH) napauswag ( Figure S6C) (Figure S6C). An pyruvate mayo nin access sa vascular.
Sa katapustapusi, nanompongan niamo na an super pathway kan serine asin glycine biosynthesis, an may relasyon na mitochondrial folate (1C) cycle asin proline biosynthesis (Figure 1G asin Figure S5C) gabos signipikanteng na-up-regulate, susog sa mga report, sa laog kan proseso nin aktibasyon. An mga nakapalibot na tisyu na-aktibo sa mitochondrial dysfunction (5-7). An confocal analysis na nagsusuporta sa mga datos na ini kan proteomics nagpahiling na sa PN na mayo an OXPHOS, an mga hiwa kan cerebellar kan 8-semana na mga ilaga ipinasairarom sa serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), sarong pangenot na enzyme kan mitochondrial folate cycle. Makahulogan na simbag kan resistensya (Figure S5D). Sa 13 CU-glucose-incubated acute cerebellar slices, an mga eksperimento sa metabolic tracing orog pang nagkumpirma kan up-regulation kan serine asin proline biosynthesis, na nagpapahiling na an flux kan mga isoform nin carbon pasiring sa serine asin proline naglangkaw (Figure S5E). Nin huli ta an mga reaksyon na pigpapauswag kan GLS asin GPT2 iyo an responsable sa paggibo nin glutamate gikan sa glutamine asin an transamination sa pag-ultanan kan glutamate asin α-ketoglutarate, an saindang pag-upregulate nagpapahiling na an mga neuron na kulang sa OXPHOS igwa nin mas halangkaw na pangangaipo para sa glutamate, Ini pwedeng may katuyuhan na mamantenir an mas halangkaw na biosynthesis kan proline (Figure S5). Sa kabaliktaran sa mga pagbabagong ini, an sarong proteomic analysis kan mga cerebellar astrocytes gikan sa PN-specific Mfn2cKO na mga ilaga nagpahiling na an mga agihan na ini (kaiba an gabos na antiperoxidases) dai nagbago nin signipikante sa ekspresyon, kaya nagpapahiling na An metabolikong redireksyon na ini mapili sa degradadong PN (Fig. S6, D sagkod G).
Sa sumaryo, an mga pag-analisar na ini naghayag nin mga magkalaen na marhay na mga halimbawa nin temporal na aktibasyon kan mga partikular na metabolikong agihan sa mga PN. Dawa ngani an abnormal na neuronal mitochondrial function pwedeng magresulta sa amay na atherosclerosis asin 1C remodeling (Figure 3E asin Figure S5C), asin dawa an mga predictable na pagbabago sa ekspresyon kan I asin IV complexes, an mga pagbabago sa serine de novo synthesis iyo sana. Ini nagin malinaw sana sa mga huring yugto. OXPHOS dysfunction (Figure 3E asin Figure S5C). An mga nadiskubre na ini nagtatao nin kahulugan sa sarong sunod-sunod na proseso kun saen an stress-induced mitochondrial (1C cycle) asin cytoplasmic (serine biosynthesis) na simbag magkasararo sa paglangkaw kan atherosclerosis sa TCA cycle tanganing liwaton an metabolismo kan neuron.
An 8-semana na OXPHOS-deficient PNs pwedeng magmantenir nin high-frequency excitation activity asin mag-agi nin signipikanteng metabolikong rekoneksyon tanganing mabayadan an mitochondrial dysfunction. An pagdiskubre na ini nagpapalataw nin sarong interesanteng posibilidad na dawa sa momentong ini, an mga selula na ini pwede man na mag-ako nin interbensyon sa pagbolong tanganing maatraso o malikayan an neurodegeneration. Huri. Naresolberan niamo an posibilidad na ini sa paagi nin duwang independienteng interbensyon. Sa enot na paagi, nagdisenyo kami nin Cre-dependent adeno-associated virus (AAV) vector tanganing an MFN2 mapili na maipahayag sa OXPHOS-deficient PNs sa vivo (Figure S7A). An AAV na nag-eencode kan MFN2 asin an fluorescent reporter gene na mCherry (Mfn2-AAV) na-verify sa mga primaryang kultura nin neuron sa vitro, na nagin dahelan na an MFN2 maipahayag sa paaging nakadepende sa Cre asin naligtas an morpolohiya kan mitochondrial, sa siring naiwasan an neuromutation sa mga neuron kan Mfn2cKO ( Figure S7, D, B asin D). Sunod, nagkondusir kami nin mga eksperimento sa vivo tanganing stereotactically na maihatod an 8-semana na Mfn2-AAV sa cerebellar cortex kan Mfn2cKO asin kontrol na mga ilaga, asin inanalisar an 12-semana na mga ilaga (Figure 4A). An mga tinawan nin Mfn2cKO na mga ilaga nagadan (Figure 1, A asin B) (16). An viral transduction sa vivo nagresulta sa selective expression kan PN sa nagkapirang cerebellar circles (Figure S7, G asin H). An pag-ineksiyon kan kontrol na AAV na nagpapahayag sana nin mCherry (Ctrl-AAV) mayo nin mahalagang epekto sa grado kan neurodegeneration sa mga hayop na Mfn2cKO. Sa kabaliktaran, an pag-analisar kan Mfn2cKOs na pig-transduce gamit an Mfn2-AAV nagpahiling nin sarong mahalagang protektibong epekto kan PN cell layer (Figure 4, B asin C). Sa partikular, an densidad kan neuron garo baga haros dai na mahihiling sa mga hayop na kontrol (Figure 4, B asin C, asin Figure S7, H asin I). An ekspresyon kan MFN1 alagad bakong MFN2 parehong epektibo sa pagligtas kan kagadanan kan neuron (Figure 4C asin Figure S7, C asin F), na nagpapahiling na an ekspresyon kan ectopic MFN1 epektibo na makakadagdag sa kakulangan kan MFN2. An dugang pang pag-analisar sa solong lebel kan PN nagpahiling na an Mfn2-AAV sa kadaklan nakaligtas sa ultrastructure kan mitochondria, na-normalize an lebel kan mtDNA, asin nabaliktad an halangkaw na ekspresyon kan anti-angiogenesis marker PCx ​​(Figure 4, C to E ). An biswal na pag-inspeksyon kan mga naligtas na Mfn2cKO na ilaga sa sarong estado nin pahingalo nagpahiling na an saindang postura asin mga sintomas sa motor (hiro S1 sagkod S3) nagrahay. Sa konklusyon, an mga eksperimentong ini nagpapahiling na an naatrasar na pag-introdusir giraray kan MFN2 sa mga PN na grabe an kakulangan sa OXPHOS igo na tanganing mabaliktad an pagkonsumo nin mtDNA asin mag-induce nin atherosclerosis, sa siring naiwasan an pagkaraot kan axon asin pagkagadan kan neuron sa vivo.
(A) Sarong iskema na nagpapahiling kan eksperimentong iskedyul para sa pag-ineksiyon nin AAV na nag-eenkode nin MFN2 kun an ipinapahiling na metabolikong agihan na-aktibo. (B) Representatibong mga retrato nin confocal kan 12-semana na mga seksyon kan cerebellar na pig-transduce gamit an Mfn2cKO na mga ilaga sa 8 na semana asin pigmarkahan nin anti-Calbindin antibody. Tuo: Pag-scale kan mga lanot kan axon. An sukol kan axon zoom 450 asin 75 μm. (C) Wala: Pagkwantipika kan densidad kan selula kan Purkinje sa AAV transduction loop (AAV+) (sarong-paagi na pag-analisar kan pagkakaiba; n = 3 na mga ilaga). Tuo: pag-analisar kan pokus kan mtDNA sa transduced PN sa semana 12 (unpaired t-test; n = 6 na mga selula gikan sa tolong ilaga). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Representatibong mga mikrograpo nin elektron na transmisyon kan mga PN kan Mfn2cKO na mga seksyon kan cerebellar na pig-transduce gamit an mga ipinapahiling na mga viral vector. An rosas na maskara nagpapahiling kan lugar na inookupar kan mga dendrite, asin an dilaw na tuldok na kwadrado nagpapahiling kan zoom na itinao sa too; an n nagrerepresentar kan nukleo. Scale bar, 1μm. (E) nagpapahiling nin sarong halimbawa nin PCx staining sa PN na pig-transduce sa 12 na semana. Scale bar, 20μm. OE, sobrang ekspresyon; FC, pagbago nin pilo.
Sa katapustapusi, inimbestigaran niamo an importansya kan peroxidase-induced cell survival sa mga PN na nakaeksperyensya nin OXPHOS dysfunction. Nagmukna kami nin mCherry na nag-eencode nin AAV-shRNA (halipot na hairpin RNA) na partikularmenteng nagtatarget sa mouse PCx mRNA (AAV-shPCx), asin pig-ineksiyon an virus o an scrambled control kaini (AAV-scr) sa cerebellum kan Mfn2cKO na mga ilaga. An ineksyon ginibo sa ikaapat na semana nin edad (Figure 5A) tanganing makamit an epektibong PCx knockdown sa panahon na an ekspresyon kan PCx naglangkaw (Figure 3C) asin an PN cell layer bilog pa (Figure 1A). Mahalagang mangnohon na an pagtumba sa PCx (Figure S8A) nagbubunga nin sarong mahalagang pagparikas kan kagadanan kan PN, na iyo sana an limitadong singsing nin impeksyon (Figure 5, B asin C). Tanganing masabutan an mekanismo kan mga epekto sa metabolismo na pinukaw kan PCx up-regulation, pinag-adalan niamo an redox status kan PNs pagkatapos kan PCx knockdown asin an AAV-mediated optical biosensor Grx1-roGFP2 na sabay na ipinahayag (Figure S8, B to D) tanganing ebalwaron an glutathione An relatibong pagbabago kan redox peptide potential (383). Dangan, nagkondusir kami nin two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) sa mga acute brain slices kan 7-semana na Mfn2cKO o mga control littermates tanganing mahiling an mga potensyal na pagbabago sa cytoplasmic redox status pagkatapos na ma-verify an mga kondisyon kan FLIM (Figure S8, E to G). An pag-analisar nagpahiling nin sarong mahalagang paglangkaw sa estado nin oksidasyon kan sarong solong Mfn2cKO PNs na kulang sa PCx expression, na iba sa mga kontrol na neuron o Mfn2cKO PNs na nagpapahayag sana nin scrambled shRNA (Figure 5, D asin E). Kun an ekspresyon kan PCx pig-down-regulate, an porsyento kan Mfn2cKO PNs na nagpapahiling nin halangkaw na oxidized na estado naglangkaw nin labing tolong beses (Figure 5E), na nagpapahiling na an PCx up-regulation nagmantenir kan redox capacity kan mga degenerated neurons.
(A) Sarong iskema na nagpapahiling kan eksperimentong iskedyul para sa pag-ineksion nin AAV na nag-eencode nin shPCx kun an ipinapahiling na metabolikong agihan na-aktibo. (B) Mga representanteng confocal na retrato kan 8-semana na mga seksyon kan cerebellar sa mga ilaga na Mfn2cKO na pig-transduce asin pigmarkahan nin anti-calcineurin antibody sa 4 na semana. Scale bar, 450μm. (C) Pagkwantipika kan densidad kan selula kan Purkinje sa mga AAV-transduced loops (one-way analysis of variance; n = 3 sagkod 4 na mga ilaga). An mga datos ipinapahayag bilang mean±SEM; ***P<0.001. (D) An representanteng ritrato kan FLIM nagpapahiling kan average na lawig nin buhay kan 7-semana na PN na nagpapahayag kan glutathione redox sensor Grx1-roGFP2 sa irarom kan mga espesipikong kondisyon kan eksperimento. LUT (look-up table) ratio: survival time interval (sa picoseconds). Scale bar, 25μm. (E) An histogram nagpapahiling kan distribusyon kan mga halaga kan buhay kan Grx1-roGFP2 gikan sa (D) (n=158 sagkod 368 na mga selula sa duwang ilaga sa irarom kan lambang kondisyon). An pie chart sa itaas kan lambang histogram: nagpapahiling kan bilang kan mga selula na may mas halawig (pula, na-oxidize) o mas halipot (asul, nabawasan) na mga halaga nin lawig nin buhay, na minalampas sa 1 SD kan average na halaga nin lawig nin buhay sa CTRL-AAV-scr. (F) An propuestong modelo nagpapahiling kan protektibong epekto kan pag-upregulate kan neuronal PCx.
Sa kabilogan, an datos na itinatao niamo digdi nagpapahiling na an re-expression kan MFN2 lubos na makakaligtas sa mga advanced PN na may grabeng kakulangan sa OXPHOS, grabeng pag-ubos kan mtDNA, asin labi-labing abnormal na ista-like morphology, sa siring nagtatao nin padagos na pag-uswag dawa sa mga advanced na helang. An neurodegeneration nagtatao nin reversible na ebidensya kan yugto bago an pagkagadan kan selula. An gradong ini nin metabolikong pagkamapag-ayon orog pang pigduduon kan kakayahan kan mga neuron na mag-induce nin atherosclerosis (sarong rewiring kan siklo kan TCA), na nag-iingat sa ekspresyon kan PCx sa mga PN na kulang sa OXPHOS asin nagpapauswag kan pagkagadan kan selula, sa siring nagkakaigwa nin protektibong papel (Figure 5F).
Sa pag-aadal na ini, nagtao kami nin ebidensya na an simbag kan mga PN sa OXPHOS dysfunction iyo an luway-luway na pag-abot sa TCA cycle atherosclerosis sa paagi kan differential activation pathway na pig-aktibo kan mga programa sa metabolismo. Kinumpirmar niamo an proteomic analysis sa kadakol na mga komplementaryong paagi asin ihinayag na kun inaagihan nin grabeng mitochondrial dysfunction, an mga neuron igwa nin dai pa aram na porma nin metabolikong pagkamapag-ayon. Sa samong pagkabigla, an bilog na proseso nin pag-rewiring dai man nanggad minamarka kan terminal na estado nin metabolismo na kaiba kan neurodegeneration nin luway-luway asin dai na mababawi, alagad an samong datos nagsusuherir na ini pwedeng magkompuesto nin sarong neuron sa pagmantenir dawa sa yugto bago an pagkagadan kan selula Functional compensation mechanism. An nakuang ini nagpapahiling na an mga neuron igwa nin konsiderableng grado nin metabolikong plasticity sa hawak. An bagay na ini nagpapatunay na an huring pag-introdusir giraray kan MFN2 puedeng magbaliktad kan ekspresyon kan mga pangenot na marker nin metabolismo asin makalikay sa pagkaraot kan PN. Sa kabaliktaran, ini nag-uulang sa atherosclerosis asin nagpaparikas kan mga nerbiyos. transsexual.
Saro sa mga pinakanakakaakit na nakua sa samong pagsiyasat iyo na an mga PN na kulang sa OXPHOS puedeng magbago kan metabolismo kan siklo kan TCA sa paagi nin pag-up-regulate kan mga enzyme na partikularmenteng nag-estimular kan arteriosclerosis. An pag-areglo liwat kan metabolismo sarong komun na tampok kan mga selula nin kanser, na an iba kaini nagsasarig sa glutamine tanganing dagdagan an mga intermediate kan siklo kan TCA tanganing makaprodusir nin mga katumbas na nagbabawas, na nagtutulod kan kadena nin paghangos asin nagmamantenir kan produksyon kan mga prekursor nin lipid asin nucleotide biosynthesis (39 , 40). An sarong dai pa sana nahahaloy na pag-aadal nagpahiling na sa mga tisyu sa luwas na nakakaeksperyensya nin OXPHOS dysfunction, an pagkonektar giraray kan metabolismo kan glutamine/glutamate sarong prominenteng tampok man (5, 41), kun saen an direksyon kan paglaog kan glutamine sa siklo kan TCA nakadepende sa Huli sa grabe kan danyos sa OXPHOS (41). ). Alagad, kulang an malinaw na ebidensya sa anuman na pagkakaagid kan neuronal metabolic plasticity sa hawak asin an posibleng pagkakaugnay kaini sa konteksto kan helang. Sa sarong dai pa sana nahahaloy na pag-aadal sa vitro, an mga primerong cortical neuron ipinaheling na nagpapahiro nin mga glutamate pool para sa neurotransmission, sa siring nagpapauswag kan oxidative metabolism asin atherosclerosis sa irarom kan mga kondisyon nin metabolikong stress (42). Mahalagang mangnohon na sa irarom kan parmasyutikong pagpugol kan TCA cycle enzyme succinate dehydrogenase, an pyruvate carboxylation pigtutubodan na nagmamantenir kan paggibo kan oxaloacetate sa mga kulturang cerebellar granule neurons (34). Alagad, an pisyolohikal na kahulugan kan mga mekanismong ini sa tisyu kan hutok (kun saen an atherosclerosis pigtutubodan na mayormenteng nakakulong sa mga astrocyte) igwa pa man giraray nin importanteng pisyolohikal na kahulugan (43). Sa kasong ini, an samong datos nagpapahiling na an mga PN na naraot kan OXPHOS sa hawak pwedeng ibalyo sa BCAA degradation asin pyruvate carboxylation, na iyo an duwang mayor na pinagkukuanan nin suplementasyon kan mga intermediate kan TCA pool. Dawa ngani an putatibong kontribusyon kan BCAA catabolism sa neuronal energy metabolism pigproponer, dugang pa sa papel kan glutamate asin GABA para sa neurotransmission (44), mayo pa man giraray nin ebidensya para sa mga mekanismong ini sa vivo. Kaya, madaling mag-isip na an mga dysfunctional PNs puedeng awtomatikong makabayad para sa pagkonsumo nin mga intermediate kan TCA na pinapaandar kan proseso nin asimilasyon sa paagi nin paglangkaw kan atherosclerosis. Sa partikular, an pag-upregulate kan PCx pwedeng kaipuhan tanganing mamantenir an mas halangkaw na pangangaipo para sa aspartic acid, na ipinaheling sa mga nagdadakol na selula na may mitochondrial dysfunction (45). Alagad, an samong pag-analisar sa metabolomics dai naghayag nin anuman na mahalagang pagbabago sa steady-state na lebel kan aspartic acid sa Mfn2cKO PNs (Figure S6A), na posibleng nagpapahiling kan manlaen-laen na metabolikong paggamit kan aspartic acid sa pag-ultanan kan mga nagdadakol na selula asin mga post-mitotic neuron. Dawa ngani an eksaktong mekanismo kan pag-upregulate kan PCx sa mga dysfunctional na neuron sa vivo dai pa nadedeterminaran, ipinaheling niamo na an amay na pagsimbag na ini igwa nin importanteng papel sa pagmantenir kan estado nin redox kan mga neuron, na ipinaheling sa mga eksperimento kan FLIM sa mga hiwa kan cerebellar. Sa partikular, an pag-ulang sa mga PN sa pag-up-regulate kan PCx puedeng magresulta sa mas oxidized na estado asin magparikas kan pagkagadan kan selula. An pag-aktibo kan pagkaraot kan BCAA asin an carboxylation kan pyruvate bakong mga paagi tanganing ma-karakterisa an mga tisyu sa luwas kan mitochondrial dysfunction (7). Kaya, garo baga sinda sarong prayoridad na tampok kan mga neuron na kulang sa OXPHOS, dawa bako sana an tampok, na mahalaga para sa neurodegeneration. .
An helang na cerebellar sarong heterogeneous na klase nin helang na neurodegenerative na parati nagpapahiling bilang ataxia asin parati nakakaraot sa mga PN (46). An populasyon na ini nin neuron partikularmenteng madaling mabiktima kan mitochondrial dysfunction huli ta an saindang selective degeneration sa mga ilaga igo na tanganing magreprodusir nin kadaklan sa mga sintomas nin motor na nagpapamidbid kan human spinocerebellar ataxia (16, 47, 48). Susog sa mga bareta, an sarong transgenic na modelo nin daga na may mutant gene konektado sa human spinocerebellar ataxia asin igwa nin mitochondrial dysfunction (49, 50), na nagduduon kan importansya kan pag-adal kan mga resulta kan kakulangan nin OXPHOS sa PNPH. Kaya, ini partikularmenteng angay na epektibo na isuway asin pag-adalan an pambihirang populasyon nin neuron na ini. Alagad, huli ta an mga PN sensitibo nanggad sa presyon asin nag-aako nin hababang proporsyon kan bilog na populasyon kan selula kan cerebellar, para sa kadakol na pag-aadal na nakabase sa omics, an selective separation kan mga ini bilang bilog na mga selula sarong masakit na aspeto pa man giraray. Dawa ngani haros imposible na makamtan an absolutong kawaran nin kontaminasyon kan ibang klase nin selula (lalo na an mga tisyu kan mga adulto), pinagsararo niamo an sarong epektibong lakdang nin pagbubulag sa FACS tanganing makakua nin supisyenteng bilang nin mga viable neuron para sa pag-analisar kan proteomics sa ibaba, asin igwa nin medyo halangkaw na sakop nin protina (mga 3000 na protina) kumpara sa eksistidong datos kan bilog na cerebel (15). Sa paagi kan pagpreserbar kan viability kan bilog na mga selula, an paagi na itinatao niamo digdi nagtutugot sa samo bako sanang na helingon an mga pagbabago sa mga agihan nin metabolismo sa mitochondria, kundi man na helingon an mga pagbabago sa mga katumbas kaini sa cytoplasmic, na nagkokomplemento sa paggamit kan mitochondrial membrane label enrichment na espesipiko sa mga klase nin selula An bagong paagi para sa bilang kan mga komplikadong mitochondria sa mga mitochondria (255, 25). An paagi na samong ilinaladawan bako sanang konektado sa pag-aadal kan mga selula nin Purkinje, kundi madaling maiaplikar sa arin man na klase nin selula tanganing masimbagan an mga pagbabago sa metabolismo sa mga may helang na hutok, kaiba an ibang mga modelo nin mitochondrial dysfunction.
Sa katapustapusi, namidbid niamo an sarong bintana sa pagbolong sa proseso nin pag-areglo giraray kan metabolismo na lubos na makakabaliktad kan mga pangenot na senyales kan stress sa selula asin makalikay sa pagkaraot kan neuron. Kaya, an pagsabot kan mga implikasyon sa pagpunsyon kan rewiring na ilinadawan digdi puedeng magtao nin pundamental na mga pananaw sa posibleng mga pagbolong para sa pagmantenir kan neuronal viability sa panahon kan mitochondrial dysfunction. An maabot na pagsiyasat na may katuyuhan na mag-dissect kan mga pagbabago sa metabolismo nin enerhiya sa ibang klase nin selula kan hutok kaipuhan tanganing lubos na ihayag an aplikabilidad kan prinsipyong ini sa ibang mga helang sa neurological.
An mga ilaga na MitoPark ilinadawan na kaidto (31). An mga ilaga na C57BL/6N na may loxP na nakapalibot sa mga gene kan Mfn2 ilinadawan na kaidto (18) asin pig-cross sa mga ilaga na L7-Cre (23). An nagresultang dobleng heterozygous na gikan dangan pig-cross sa homozygous Mfn2loxP/Mfn2loxP na mga ilaga tanganing makagibo nin mga Purkinje-specific gene knockouts para sa Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Sa sarong subset nin pag-agom, an Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP allele (stop-mtYFP) ipinamidbid sa paagi nin dagdag na mga krus (20). An gabos na prosedimiento sa hayop ginibo susog sa mga giya kan Europa, nasyonal asin institusyonal asin inaprobaran kan LandesamtfürNatur kan Umwelt asin Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Alemania. An trabaho sa hayop nagsusunod man sa giya kan European Federation of Laboratory Animal Sciences Associations.
Pagkatapos na ma-anestisya an cervical dislocation kan bados na babae, an embryo kan mouse pigbubulag (E13). An cortex pig-dissect sa Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) na pigdagdagan nin 10 mM Hepes asin ipinasa sa Dulbecco's Modified Eagle's Medium na igwa nin papain (20 U/ml) asin cysteine ​​(1μg/ml). I-inkubar an tisyu sa DMEM) asin i-dissociate ini sa paagi nin enzymatic digestion. Ml) sa 37°C sa laog nin 20 minutos, dangan mekanikal na giniling sa DMEM na pigdagdagan nin 10% na fetal bovine serum. An mga selula itinanom sa mga takop na salming na pinatos nin polylysine sa densidad na 2×106 kada 6 cm na pinggan nin kultura o sa densidad na 0.5×105 na mga selula/cm2 para sa pag-analisar nin imaging. Pakalihis nin 4 na oras, an medium sinalidahan nin Neurobasal serum-free medium na igwa nin 1% B27 supplement asin 0.5 mM GlutaMax. An mga neuron dangan pinagdanay sa 37°C asin 5% CO2 sa bilog na eksperimento, asin pinakakan nin sarong beses kada semana. Tanganing ma-induce an rekombinasyon sa vitro, 3μl (24-well culture dish) o 0.5μl (24-well plate) kan minasunod na AAV9 virus vector an ginamit sa pagbolong kan mga neuron sa ikaduwang aldaw sa vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, numero nin katalogo 105530-AAV9) asin AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, numero nin katalogo 105545-AAV9).
An Mouse Mfn1 asin Mfn2 na komplementaryong DNA (na nakua sa Addgene plasmid #23212 asin #23213, sunod-sunod) minarkahan kan V5 sequence (GKPIPNPLLGLDST) sa C-terminus, asin pinagsararo sa mCherry sa frame sa paagi kan T2A sequence. An Grx1-roGFP2 sarong regalo hale sa Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Sa paagi kan pagsalida kan tdTomato cassette gamit an mga kombensyonal na paagi nin pag-clone, an cassette pig-subclone sa pAAV-CAG-FLEX-tdTomato backbone (Addgene reference number 28306) tanganing makagibo nin pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-G FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 asin pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 na mga vector. Sarong kaparehong estratehiya an ginamit tanganing makagibo nin kontrol na vector na pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Tanganing makagibo nin AAV-shPCx construct, sarong plasmid AAV vector (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) an kaipuhan, na igwa kan DNA sequence na nag-eencode kan shRNA na nagtatarget sa mouse PCx (5′CTTTCGCTACCTAGGCTAAGGCTAAGGACTTAGACTTAGA 3′) Sa irarom kan kontrol kan U6 promoter, an mCherry ginagamit sa irarom kan kontrol kan CMV promoter. An produksyon kan mga auxiliary AAV vectors ginibo susog sa mga instruksyon kan paragibo (Cell Biolabs). Sa halipot na pagtaram, gumamit nin transfer plasmid na may darang mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) transiently Transfection of 29AV-MFN2-V5-MFN2-V5 mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) o Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) coding gene, siring man coding AAV1 capsid protein asin accessory protein Packaging plasmid plasmid, gamit an paagi nin calcium phosphate. An krudong supernatant kan virus nakua sa paagi nin mga siklo nin pagyelo-pagtunaw sa sarong dry ice/ethanol bath asin mga lysed na selula sa phosphate buffered saline (PBS). An AAV vector pigdalisay sa paagi nin discontinuous iodixanol gradient ultracentrifugation (24 oras sa 32,000 rpm asin 4°C) asin pigkonsentrar gamit an Amicon ultra-15 centrifugal filter. An titer kan genome kan AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 genome copy (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX iyo an dati nang ilinadawan (45), sa paagi nin realtime quantitative PCR (PCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) asin AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
An mga primerong neuron pig-scrape off sa ice-cold 1x PBS, pig-pellet, dangan pig-homogenize sa 0.5% Triton X-100 / 0.5% sodium deoxycholate/PBS lysis buffer na igwang phosphatase asin protease inhibitor (Roche). An pagkwantipika kan protina ginibo gamit an bicinchoninic acid assay (Thermo Fisher Scientific). An mga protina dangan pinagsuhay sa paagi nin SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, dangan pig-blot sa sarong polyvinylidene fluoride membrane (GE Healthcare). I-block an mga bakong espesipikong lugar asin i-incubate sa primerong antibody (hilingon an Table S1 para sa mga detalye) sa 5% na gatas sa TBST (Tris-buffered saline na may Tween), mga lakdang sa paghugas asin segundaryong antibody sa TBST Incubate. I-inkubar sa primerong antibody sa bilog na banggi sa +4°C. Pagkatapos maghugas, ilaag an segundaryong antibody sa laog nin 2 oras sa temperatura kan kwarto. Dangan, sa paagi nin pag-inkubar kan parehong blot na may anti-β-actin antibody, an parehong pagkarga nakumpirma. Pagdetektar sa paagi nin pagkombertir sa chemiluminescence asin pagpapauswag kan chemiluminescence (GE Healthcare).
An mga neuron na dati nang itinanom sa mga coverslip na salming pig-ayos gamit an 4% paraformaldehyde (PFA)/PBS sa itinalaan na punto nin oras sa temperatura kan kwarto sa laog nin 10 minutos. An mga coverslips enot na pigbubugtakan nin 0.1% Triton X-100/PBS sa laog nin 5 minutos sa temperatura kan kwarto, dangan sa blocking buffer [3% bovine serum albumin (BSA)/PBS]. Sa ikaduwang aldaw, an mga coverslip hinugasan gamit an blocking buffer asin pig-inkubar gamit an maninigong fluorophore-conjugated secondary antibody sa laog nin 2 oras sa temperatura kan kwarto; sa katapustapusi, an mga sample hinugasan nin marhay sa PBS na may 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) na pig-counterstain asin dangan pig-ayos sa slide kan mikroskopyo gamit an Aqua-Poly/Mount.
An mga ilaga (lalaki asin babae) pig-anestisya sa paagi nin intraperitoneal injection nin ketamine (130 mg/kg) asin xylazine (10 mg/kg) asin pig-administrar sa irarom kan kublit na may carprofen analgesic (5 mg/kg), asin ibinugtak sa sarong stereotactic instrumento (Kopf) na may warm. Ibuyagyag an kalabera asin gamiton an dental drill tanganing manipison an parte kan cerebellar cortex na katumbas kan mis bone (gikan sa lambda: ikog 1.8, lateral 1, katumbas kan lobules IV asin V). Gamiton an kurbadong dagom nin hiringgilya tanganing maingat na makagibo nin sadit na labot sa kalabera tanganing maibitaran an pagkadisturbo kan mga ugat sa ibaba. Dangan an manipis na ginuhit na salming na kapilarya luway-luway na piglalaog sa micro-hole (poon -1.3 sagkod -1 sa ventral na lado kan dura mater), asin 200 sagkod 300 nl AAV pig-iinject sa micro-injector (Narishige) gamit an mga manual syringe (Narishige) nin nagkapirang beses sa hababang presyon sa laog nin 20 minutos sagkod 20 minutos. Pagkatapos kan pag-infuse, ibugtak an capillary sa laog nin 10 minutos pa tanganing an virus maglakop nin lubos. Pagkatapos na haleon an mga kapilarya, an kublit tinatahi nin maingat tanganing mabawasan an pag'alburuto kan lugad asin tugutan an hayop na makabawi. An mga hayop tinawan nin mga analgesic (caspofen) sa laog nin pirang aldaw pagkatapos kan operasyon, na sa laog kan panahon na ini an saindang pisikal na kamugtakan maingat na binabantayan dangan sinda pinagadan sa sinabing punto nin oras. An gabos na prosedimiento ginibo susog sa mga giya kan Europa, nasyonal asin institusyonal asin inaprobaran kan LandesamtfürNatur kan Umwelt asin Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Germany.
An mga hayop pig-anestisya nin ketamine (100 mg/kg) asin xylazine (10 mg/kg), asin an puso pig-perfuse nin 0.1 M PBS nguna, dangan nin 4% PFA sa PBS. An tisyu pig-dissect asin pig-ayos sa 4% PFA/PBS sa bilog na banggi sa 4°C. Sarong nagkukubogkubog na kutsilyo (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) an ginamit sa pag-andam nin mga seksyon na sagittal (50 μm an kapal) gikan sa nakapirming hutok sa PBS. Apwera kun iba an sinasabi, an pagmantsa kan mga libreng naglalataw na mga seksyon ginibo siring sa ipinaliwanag sa itaas (13) sa temperatura kan kwarto asin pag-ipit. Sa halipot na pagtaram, enot, an mga nakuang hiwa pig-permeabilize gamit an 0.5% Triton X-100/PBS sa laog nin 15 minutos sa temperatura kan kwarto; para sa nagkapirang epitopes (Pcx asin Shmt2), sa paagi nin tris-EDTA buffer sa 80°C (PH 9) painiton an mga hiwa sa laog nin 25 minutos imbes na an lakdang na ini. Sunod, an mga seksyon pig-inkubar sa primaryang antibody (hilingon an Table S1) sa blocking buffer (3% BSA/PBS) sa 4°C sa bilog na banggi na may pag-ipit. Kan sunod na aldaw, an mga seksyon hinugasan gamit an blocking buffer asin pig-inkubar gamit an maninigong fluorophore-conjugated secondary antibody sa laog nin 2 oras sa temperatura kan kwarto; sa katapustapusi, an mga seksyon hinugasan nin marhay sa PBS, pig-counter-stain gamit an DAPI, dangan pig-ayos gamit an AquaPolymount Sa sarong slide nin mikroskopyo.
Sarong laser scanning confocal microscope (TCS SP8-X o TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) na igwa nin puting liwanag na laser asin sarong 405 diode ultraviolet laser an ginamit sa pag-imahe kan sample. Sa paagi nin pag-excite kan fluorophore asin pagkolekta kan signal gamit an Hybrid Detector (HyDs), an software kan LAS-X ginamit tanganing magkolekta nin mga naka-stack na imahe na nagsusunod sa Nyquist sampling sa sequential mode: para sa mga non-quantitative panel, ini mga highly dynamic signals (halimbawa, sa mga somatic cells asin dendrites) mtY FPD tanganing ma-detect an Hybrid Detector sa tuo na numero kan BPNRs mode). An pag-gate na 0.3 sagkod 6 ns pig-aaplikar tanganing mabawasan an background.
Real-time na pag-imahe kan mga pinag-urulay na selula. Pagkatapos kan pag-sort sa Neurobasal-A medium na igwa nin 1% B27 supplement asin 0.5 mM GlutaMax, an mga selula tulos na pig-seed sa mga poly-l-lysine-coated glass slides (μ-Slide8 Well, Ibidi, catalog number 80826) , Dangan pinapagdanay ini sa 37°C asin 15% CO sa laog nin sarong oras tanganing an selula magtugot ayuson. An real-time imaging ginibo sa sarong Leica SP8 laser scanning confocal microscope na igwa nin puting laser, HyD, 63×[1.4 numerical aperture (NA)] oil objective lens asin sarong heating stage.
An mouse marikas na pig-anestisya gamit an carbon dioxide asin pinutol an payo, an hutok marikas na hinale sa kalabera, asin pinutol sa 200μm na kapal (para sa 13C na eksperimento sa pagmarka) o 275μm na kapal (para sa duwang eksperimento sa photon) na sagittal na seksyon na pano kan minasunod na mga materyales An sorbetes (HM-605, VHer, Scientific Walldorf, Germany) pano kan minasunod na mga substansya: 125 mM ice-cold, carbon-saturated (95% O2 asin 5% CO2) hababang Ca2 + artipisyal na pluwido kan cerebrospinal (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, NaCl 5 MM, 25 mM gluse 0.5 mM CaCl2 asin 3.5 mM MgCl2 (osmotic pressure na 310 sagkod 330 mmol). Ibalyo an mga nakuang hiwa nin hutok sa sarong pre-incubation chamber na igwa nin mas halangkaw na Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 10 mM asin 20 mM Ca. MgCl2) Medium) pH 7.4 asin 310 sagkod 320 mmol).
Durante kan proseso nin pag-imahe, an mga hiwa ibinalyo sa sarong dedikadong kwarto sa pag-imahe, asin an eksperimento ginibo sa irarom kan padagos na pag-perfusion kan ACSF sa sarong danay na temperatura na 32° sagkod 33°C. Sarong multiphoton laser scanning microscope (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) na igwa nin Leica 25x objective lens (NA 0.95, tubig), Ti: Sapphire laser (Chameleon Vision II, Coherent) an ginamit para sa slice imaging. FLIM module (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM kan Grx1-roGFP2. An mga pagbabago sa cytoplasmic redox state kan PNs pigsukol sa paagi nin two-photon FLIM sa sagittal brain slices, kun saen an Grx1-roGFP2 biosensor pigtarget an mga PNs. Sa PN layer, an acquisition field pinipili mga 50 sagkod 80 μm sa ibaba kan ibabaw kan slice tanganing maseguro na igwa nin sarong viable PN (an boot sabihon, an kawaran nin beaded structure o mga pagbabago sa morpolohiya kan neuronal sa mga dendrite) asin an dobleng positibong roGFP2 sensor asin AAV na nag-eencode kan shRNA PCx o an pagkasunod-sunod kaini (na nagkokontrol nin lambang Cherry). Magtipon nin mga single-stack na imahe na may 2x digital zoom [excitation wavelength: 890 nm; 512 nm 512 piksel]. Pagdetektar: panlaog na HyD, fluorescein isothiocyanate (FITC) filter group] asin pag-average kan imahe sa laog nin 2 sagkod 3 minutos ginagamit tanganing maseguro na igwa nin igong mga photon na nakolekta (1000 na photon sa kabilugan) para sa pag-fit kan kurba. An pagkasensitibo kan Grx1-roGFP2 probe asin an pag-verify kan mga kondisyon kan FLIM ginibo sa paagi nin pagbantay kan halaga kan lifespan kan roGFP2 kun nagdadagdag nin exogenous 10 mM H2O2 sa perfusion ACSF (tanganing ma-maximize an oxidation, na nagreresulta sa mas halangkaw na lifespan), dangan an pagdagdag nin 2 mM dithiothreit (na nagreresulta sa pagbawas kan grado nin pagbawas, pagbaba sa lawig nin buhay) (Figure S8, D sagkod G). Gamiton an FLIMfit 5.1.1 software tanganing analisaron an mga nakuang resulta, i-fit an solong eksponensial na kurba nin pagkaraot kan bilog na imahe sa sinusukol na IRF (instrument response function), asin an χ2 mga 1. Tanganing makalkulo an lawig nin buhay kan sarong solong PN, an maskara sa palibot kan hawak kan nerbiyos mano-manong pigdrowing, an sarong average na lawig nin maskara ginamit para sa lambang maskara.
Pag-analisar kan potensyal kan mitochondrial. Pagkatapos na an acute section na-inkubar na may 100 nM TMRM na direktang idinagdag sa perfused ACSF sa laog nin 30 minutos, an mga pagbabago sa potensyal kan mitochondrial kan PNs sinusukol gamit an sarong two-photon microscope. An TMRM imaging ginibo sa paagi nin pag-excite kan probe sa 920 nm asin paggamit kan internal HyD (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) tanganing magkolekta nin mga signal; sa paagi kan paggamit kan parehong wavelength nin pagpukaw alagad paggamit nin ibang panlaog na HyD (FITC :525/50) tanganing imahe an mtYFP. Gamiton an ImageJ's Image Calculator plug-in tanganing ebalwaron an potensyal kan mitochondrial sa lebel kan solong selula. Sa halipot na pagtaram, an plug-in equation: signal = min (mtYFP, TMRM) ginagamit tanganing mamidbid an rehiyon kan mitochondrial na nagpapahiling kan TMRM signal sa Purkinje Somali sa single-stack confocal image kan katumbas na channel. Dangan an pixel area sa nagresultang maskara pig-quantify, dangan pig-normalize sa katumbas na threshold single-stack image kan mtYFP channel tanganing makua an mitochondrial fraction na nagpapahiling kan mitochondrial potential.
An imahe pig-deconvolute gamit an Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) software. Para sa mga naka-scan na ritrato kan mga baldosa, an pag-montage kan sarong baldosa ginigibo gamit an automatic stitching algorithm na itinatao kan LAS-X software. Pagkatapos kan kalibrasyon kan imahe, gamiton an ImageJ asin Adobe Photoshop tanganing orog pang maproseso an imahe asin unipormadong i-adjust an kaliwanagan asin pagkakaiba. Gamiton an Adobe Illustrator para sa pag-andam nin mga graphic.
mtDNA focus analysis. An bilang kan mga lesyon kan mtDNA pig-quantify sa mga seksyon kan cerebellar na may mga antibodies laban sa DNA sa paagi nin confocal microscope. An lambang target na lugar ginibo para sa hawak kan selula asin an nukleo kan lambang selula, asin an kanya-kanyang lugar kinarkulo gamit an Multi Measure plug-in (ImageJ software). Ibawas an nukleyar na lugar sa lugar kan hawak kan selula tanganing makua an lugar kan sitoplasma. Sa katapustapusi, an Analyze Particles plug-in (ImageJ software) ginamit tanganing awtomatikong ma-quantify an mga punto kan cytoplasmic DNA na nagpapahiling kan mtDNA sa threshold image, asin an mga nakuang resulta pig-normalize sa PN average kan CTRL na mga ilaga. An mga resulta ipinapahayag bilang an average na bilang kan mga nucleoside kada selula.
Pag-analisar kan ekspresyon kan protina. Gamiton an ImageJ's Image Calculator plug-in tanganing ebalwaron an ekspresyon kan protina sa PN sa lebel kan solong selula. Sa halipot na pagtaram, sa single-layer confocal image kan katumbas na channel, sa paagi kan ekwasyon: signal = min (mtYFP, antibody), an rehiyon kan mitochondria na nagpapahiling nin immunoreactivity sa sarong antibody sa Purkina nabibisto. Dangan an pixel area sa nagresultang maskara pig-quantify, dangan pig-normalize sa katumbas na threshold single-stack image kan mtYFP channel tanganing makua an mitochondrial fraction kan ipinapahiling na protina.
Pag-analisar kan densidad kan selula kan Purkinje. An Cell Counter plug-in kan ImageJ ginamit sa pag-ebalwar kan densidad kan Purkinje sa paagi nin pagbanga kan bilang kan mga selula kan Purkinje na binilang sa laba kan singsing kan cerebellar na inookupar kan mga binilang na selula.
Pag-andam asin pagkolekta nin sampol. An mga hutok gikan sa grupong kontrol asin Mfn2cKO na mga ilaga pig-ayos sa 2% PFA/2.5% glutaraldehyde sa 0.1 M phosphate buffer (PB), dangan an mga seksyon na koronal pig-andam gamit an mga ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (Kapal 50 sagkod 60) An pag-ayos sa P1% buffer sa 1% B tetraoxide asin 1.5% potassium ferrocyanide sa temperatura kan kwarto sa laog nin 1 oras. An mga seksyon hinugasan nin tolong beses gamit an distilled water, dangan tinina nin 70% ethanol na igwa nin 1% uranyl acetate sa laog nin 20 minutos. An mga seksyon dangan pig-dehydrate sa graded alcohol asin pig-embed sa Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences, catalog number 14040) sa pag-ultanan kan mga silicon-coated glass slides, asin sa katapustapusi sa 60°C Polymerize sa oven sa laog nin 48 oras. An lugar kan cerebellar cortex pinili asin an 50 nm na ultrathin na mga seksyon pinutol sa Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) asin pinurot sa sarong 2×1 mm na copper slit grid na pinatos nin polystyrene film. An mga seksyon tinina nin solusyon nin 4% uranyl acetate sa H2O sa laog nin 10 minutos, hinugasan nin H2O nin nagkapirang beses, dangan nin Reynolds lead citrate sa H2O sa laog nin 10 minutos, dangan hinugasan nin H2O nin nagkapirang beses. An mga mikrograpo kinua gamit an transmission electron microscope Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gamit an TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 digital camera (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Alemanya).
Para sa mga ilaga na naulakitan nin AAV, an hutok pinagsuhay asin pinutol sa sarong 1 mm na kapal na sagittal na seksyon, asin an cerebellum pig-eksamin gamit an sarong fluorescence microscope tanganing mamidbid an singsing na naulakitan nin AAV (an boot sabihon, mCherry expressing). An mga eksperimento sana kun saen an pag-ineksiyon nin AAV nagbubunga nin halangkaw na marhay na transduction efficiency kan Purkinje cell layer (ie haros an bilog na layer) sa dai mababa sa duwang magkasunod na cerebellar rings an ginagamit. An AAV-transduced loop pig-microdissect para sa bilog na banggi pagkatapos kan pag-ayos (4% PFA asin 2.5% glutaraldehyde sa 0.1 M cocoate buffer) asin orog pang pigproseso. Para sa EPON embedding, an nakapirming tisyu hinugasan gamit an 0.1 M sodium cocoate buffer (Applichem), asin pig-inkubar gamit an 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) sa 0.1 M sodium cocoate buffer (Applichem) 4 na oras, dangan hinugasan sa laog nin 2 oras. Utruhon nin 3 beses gamit an 0.1 M cocamide buffer. Dangan, an nag-iitaas na serye nin ethanol ginamit tanganing i-inkubar an lambang solusyon nin ethanol sa 4°C sa laog nin 15 minutos tanganing ma-dehydrate an tisyu. An tisyu ibinalyo sa propylene oxide asin pig-inkubar sa bilog na banggi sa EPON (Sigma-Aldrich) sa 4°C. Ibugtak an tisyu sa preskong EPON sa temperatura kan kwarto sa laog nin 2 oras, dangan ibugtak ini sa 62°C sa laog nin 72 oras. Gamiton an ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) asin sarong kutsilyong brilyante (Diatome, Biel, Switzerland) tanganing putolon an 70 nm na ultrathin na mga seksyon, asin mantsahan nin 1.5% uranyl acetate sa laog nin 15 minutos sa 37°C, asin mantsahan nin solusyon na lead citrate sa laog nin 4 minutos. An mga mikrograpo nin elektron kinua gamit an sarong JEM-2100 Plus transmission electron microscope (JEOL) na igwa nin Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) asin DigitalMicrograph software (Gatan). Para sa pag-analisar, an mga mikrograpo nin elektron nakua gamit an 5000× o 10,000× digital zoom.
Pag-analisar kan morpolohiya kan mitochondria. Para sa gabos na pag-analisar, an mga kurba kan indibidwal na mitochondria mano-manong pigbalangkas sa mga digital na imahe gamit an ImageJ software. An manlaen-laen na mga parametro sa morpolohiya inaanalisar. An densidad kan mitochondria ipinapahayag bilang sarong porsyento na nakua sa paagi nin pagbanga kan total na lugar kan mitochondria kan lambang selula sa lugar kan cytoplasm (lugar kan cytoplasm = lugar kan selula-lugar kan nukleo kan selula) × 100. An pagkabilog kan mitochondria kinakalkulo sa pormula na [4π∙(area/perimeter 2)]. An ista morpolohiya kan mitochondria pinag-analisar asin pinagbanga sa duwang kategorya ("tubular" asin "blister") susog sa saindang mga mayor na porma.
Pag-analisar kan bilang asin densidad kan autophagosome/lysosome. Gamiton an ImageJ software tanganing mano-manong i-outline an mga kurba kan lambang autophagosome/lysosome sa digital na imahe. An lugar kan autophagosome/lysosome ipinapahayag bilang sarong porsyento na kinakalkulo sa paagi nin pagbanga kan total na lugar kan estruktura kan autophagosome/lysosome kan lambang selula sa lugar kan cytoplasm (lugar kan cytoplasm=lugar kan selula-lugar kan nukleo)×100. An densidad kan mga autophagosome/lysosome kinakalkulo sa paagi nin pagbanga kan total na bilang sa bilang kan mga estruktura nin autophagosome/lysosome kada selula (sa termino kan cytoplasmic area) (cytoplasmic area = cell area-nuclear area).
Pagmarka para sa acute sectioning asin pagpreparar nin sample. Para sa mga eksperimento na nangangaipo nin pagmarka nin glucose, ibalyo an mga acute brain slices sa sarong pre-incubation chamber, na igwa nin saturated carbon (95% O2 asin 5% CO2), halangkaw na Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 2.5 mM MM NaCl, 2.5 mM NaCl. d-glucose, 1.0 mM CaCl 2 asin 2.0 mM MgCl 2, na pig-adjust sa pH 7.4 asin 310 sagkod 320 mOsm), kun saen an glucose 13 C 6- Glucose substitution (Eurisotop, numero nin katalogo CLM-1396). Para sa mga eksperimento na nangangaipo nin pagmarka nin pyruvate, ibalyo an mga acute brain slices sa mas halangkaw na Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 10 mM Ca.Cml asin Ad. MgCl2, i-adjust sa pH 7.4 asin 310 sagkod 320mOsm), asin magdagdag nin 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, numero nin katalogo CLM-1082). I-inkubar an mga seksyon sa laog nin 90 minutos sa 37°C. Sa katapusan kan eksperimento, an mga seksyon marikas na hinugasan gamit an sarong tubigon na solusyon (pH 7.4) na igwa nin 75 mM ammonium carbonate, dangan pig-homogenize sa 40:40:20 (v:v:v) acetonitrile (ACN): methanol: tubig. Pagkatapos na an mga seksyon i-inkubar sa yelo sa laog nin 30 minutos, an mga sample pig-centrifuge sa 21,000 g sa laog nin 10 minutos sa 4°C, asin an malinaw na supernatant pinamara sa sarong SpeedVac concentrator. An resultang pinatuyong metabolite pellet itinago sa -80°C sagkod na ma-analisar.
Liquid chromatography-mass spectrometry analysis kan 13 C-labeled amino acids. Para sa pag-analisar kan liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), an metabolite pellet pig-resuspend sa 75μl kan LC-MS grade water (Honeywell). Pagkatapos kan sentrifugasyon sa 21,000 g sa laog nin 5 minutos sa 4°C, 20 μl kan piglinaw na supernatant an ginamit para sa pag-analisar kan amino acid flux, mantang an natatada pang extract tulos na ginamit para sa pag-analisar kan anion (hilingon sa ibaba). An pag-analisar kan amino acid ginibo gamit an dati nang ilinadawan na benzoyl chloride derivatization protocol (55, 56). Sa enot na lakdang, 10μl kan 100 mM sodium carbonate (Sigma-Aldrich) an idinagdag sa 20μl kan metabolite extract, dangan 10μl kan 2% benzoyl chloride (Sigma-Aldrich) an idinagdag sa LC grade ACN. An sample pig-vortex nin halipot dangan pig-centrifuge sa 21,000 g sa laog nin 5 minutos sa 20°C. Ibalyo an hinale na supernatant sa sarong 2 ml na autosampler vial na may conical glass insert (200 μl na volume). An mga sample pig-analisar gamit an Acquity iClass ultra-high performance LC system (Waters) na konektado sa Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) high-resolution precision mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Para sa pag-analisar, 2μl kan derivatized sample an pig-ineksiyon sa sarong 100×1.0 mm high-strength silica T3 column (Waters) na igwa nin 1.8μm na mga partikulo. An flow rate 100μl/min, asin an buffer system igwa nin buffer A (10 mM ammonium formate asin 0.15% formic acid sa tubig) asin buffer B (ACN). An gradient iyo an minasunod: 0%B sa 0 minutos; 0%B. 0 sagkod 15% B sa 0 sagkod 0.1 minutos; 15 sagkod 17% B sa 0.1 sagkod 0.5 minutos; B sa 17 sagkod 55% sa 0.5 sagkod 14 minutos; B sa 55 sagkod 70% sa 14 sagkod 14.5 minutos; sa 14.5 sagkod 70 sagkod 100% B sa 18 minutos; 100% B sa 18 sagkod 19 minutos; 100 sagkod 0% B sa 19 sagkod 19.1 minutos; 0% B sa 19.1 sagkod 28 minutos (55, 56). An QE-HF mass spectrometer nag-ooperar sa positibong ionization mode na may mass range na m/z (mass/charge ratio) na 50 sagkod 750. An pig-aaplay na resolusyon 60,000, asin an gain control (AGC) ion target na nakua 3×106, asin an pinakahalangkaw na ion time 10 milliseconds. An pinainit na electrospray ionization (ESI) na pinagkukuanan nag-ooperar sa sarong boltahe nin spray na 3.5 kV, sarong temperatura nin kapilarya na 250°C, sarong sheath airflow na 60 AU (arbitrary units), asin sarong auxiliary airflow na 20 AU. 250°C. An S lens nakabugtak sa 60 AU.
Anion chromatography-MS pag-analisar kan 13C na may marka na mga organikong asido. An natatadang metabolite precipitate (55μl) pig-analisar gamit an Dionex ion chromatography system (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) na konektado sa sarong QE-HF mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Sa halipot na tataramon, 5μl kan metabolite extract an pig-ineksiyon sa sarong Dionex IonPac AS11-HC column na igwa nin HPLC (2 mm×250 mm, sukol kan partikulo 4μm, Thermo Fisher Scientific) sa push-in partial loop mode na may filling ratio na 1. )on. Dionex IonPac AG11-HC guard column (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). An temperatura kan kolum pinapagdanay sa 30°C, asin an autosampler nakabugtak sa 6°C. Maggamit nin potassium hydroxide cartridge na may deionized water tanganing makagibo nin potassium hydroxide gradient sa paagi kan eluent generator. Pagbubulag kan mga metabolite sa sarong flow rate na 380μl/min, na pig-aaplay an minasunod na gradient: 0 sagkod 3 minutos, 10 mM KOH; 3 sagkod 12 minutos, 10 sagkod 50 mM KOH; 12 sagkod 19 minutos, 50 sagkod 100 mM KOH; 19 sagkod 21 minutos, 100 mM KOH; 21 sagkod 21.5 minutos, 100 sagkod 10 mM KOH. An kolum pig-equilibrate giraray sa irarom kan 10 mM KOH sa laog nin 8.5 minutos.
An mga na-elute na metabolite pinagsasaro sa sarong 150μl/min na isopropanol supplement stream pagkatapos kan kolum asin dangan pigdidirehir sa sarong high-resolution mass spectrometer na nag-ooperar sa negatibong ionization mode. An MS nagmomonitor kan mass range poon m/z 50 sagkod 750 na may resolusyon na 60,000. An AGC nakabugtak sa 1×106, asin an pinakahalangkaw na oras kan ion pinapagdanay sa 100 ms. An pinainit na ESI source pig-operar sa spray voltage na 3.5 kV. An ibang mga setting kan pinagkukuanan nin ion iyo an minasunod: temperatura kan kapilarya 275°C; sheath gas flow, 60 AU; auxiliary gas flow, 20 AU sa 300°C, asin an S lens setting sa 60 AU.
Pag-analisar kan datos kan 13C na may marka na mga metabolite. Gamiton an TraceFinder software (bersyon 4.2, Thermo Fisher Scientific) para sa pag-analisar kan datos kan isotope ratio. An pagkakakilanlan kan lambang compound pig-verify kan sarong masasarigan na reperensya na compound asin independienteng pig-analisar. Tanganing magibo an pag-analisar sa pagpayaman kan isotopo, an lugar kan nakuang ion chromatogram (XIC) kan lambang 13C isotope (Mn) kinua gikan sa [M + H] +, kun saen an n iyo an numero nin karbon kan target na compound, na ginagamit sa pag-analisar kan mga amino acid o [ MH] + ginagamit sa pag-analisar kan mga anion. An pagkaeksakto kan masa kan XIC mas hababa sa limang parte kada milyon, asin an pagkaeksakto kan RT 0.05 minutos. An pag-analisar nin pagpayaman ginigibo sa paagi nin pagkalkulo kan ratio kan lambang nadetektar na isotopo sa suma kan gabos na isotopo kan katumbas na compound. An mga ratio na ini itinatao bilang mga halaga nin porsyento para sa lambang isotopo, asin an mga resulta ipinapahayag bilang molar percent enrichment (MPE), siring sa ipinaliwanag kaidto (42).
An nagyelo na neuron pellet pig-homogenize sa ice-cold 80% methanol (v/v), pig-vortex, asin pig-inkubar sa -20°C sa laog nin 30 minutos. I-vortex giraray an sample asin pukawon sa +4°C sa laog nin 30 minutos. An sample pig-centrifuge sa 21,000 g sa laog nin 5 minutos sa 4°C, dangan an resultang supernatant tinipon asin pinamara gamit an SpeedVac concentrator sa 25°C para sa kasunod na pag-analisar. Siring sa ipinaliwanag sa itaas, an pag-analisar kan LC-MS ginibo sa mga amino acid kan mga pinag-urulay na mga selula. Gamit an TraceFinder (bersyon 4.2, Thermo Fisher Scientific), an pag-analisar kan datos ginibo gamit an monoisotopic mass kan lambang compound. An quantile normalization kan datos kan metabolite ginibo gamit an preprocessCore software package (57).
Pag-andam sa hiwa. An mouse marikas na pig-anestisya nin carbon dioxide asin pinugotan, an hutok marikas na hinale sa kalabera, asin an kutsilyong pano nin yelo na nagkukubogkubog (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) ginamit tanganing putolon ini sa 300 sagkod 375 μm na sagittal na seksyon nin carbon dioxide (25% O) Hababang Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 asin 6.0 mM MgCl2 I-adjust sa pH 7 asin 30 mO 30). Ibalyo an mga nakuang hiwa nin hutok sa sarong silid na igwa nin mas halangkaw na Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 4.0 ml Ca 2 mM asin 5 MM mg 7.4 asin 310 sagkod 320 mOsm). Itago an mga hiwa sa laog nin 20 sagkod 30 minutos tanganing maibalik ini bago irekord.
pagrekord. Sarong entablado nin mikroskopyo na igwa nin nakapirming silid nin pagrekord asin sarong 20x na lente nin obhetibo sa paglubog sa tubig (Scientifica) an ginamit para sa gabos na pagrekord. An mga putative Purkinje cells nabisto sa paagi nin (i) kadakulaan kan hawak, (ii) anatomikal na lokasyon kan cerebellum, asin (iii) ekspresyon kan fluorescent mtYFP reporter gene. An patch pipette na may tip resistance na 5 sagkod 11 megohms pigbubutong sa paagi nin sarong borosilicate glass capillary (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Germany) asin sarong horizontal pipette Instruments (P-10000), Sutter Notova, CA). An gabos na pagrekord ginibo kan ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, Germany), na pigkontrol kan software na Signal (bersyon 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). An eksperimento naitala sa sampling rate na 12.5 kHz. An signal sinasala gamit an duwang short-pass Bessel filter na may mga cutoff frequency na 1.3 asin 10 kHz nin magkasunod. An kapasidad kan lamad asin kan pipeta nababayaran kan sirkito nin pagbayad gamit an amplifier. An gabos na eksperimento ginibo sa irarom kan kontrol kan sarong Orca-Flash 4.0 na kamera (Hamamatsu, Gerden, Germany), na kontrolado kan Hokawo software (bersyon 2.8, Hamamatsu, Gerden, Germany).
Rutina na pagsasaayos asin pag-analisar kan bilog na selula. Bago tulos magrekord, panoon an pipette kan panlaog na solusyon na igwa kan minasunod na mga substansya: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM potassium gluconate, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (MM MM), 5 MM triphone. (GTP) (Na) asin 10.0 mM creatinine phosphate pig-adjust sa pH 7.25, asin an osmotic pressure 290 mOsm (sucrose). Tulos pagkatapos na mag-aplay nin pwersa na 0 pA tanganing mabari an lamad, an potensyal kan lamad na nagpapahingalo sinukol. An input resistance sinusukol sa paagi nin pag-aplay nin mga hyperpolarized na sulog na -40, -30, -20, asin -10 pA. Sukdon an magnitude kan simbag kan boltahe asin gamiton an ley ni Ohm tanganing makalkulo an resistensya kan input. An spontaneous na aktibidad naitala sa sarong voltage clamp sa laog nin 5 minutos, asin an sPSC namidbid asin nasukol sa Igor Pro (bersyon 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) gamit an sarong semi-automatic recognition script. An IV curve asin steady-state current sinusukol sa paagi nin pag-clamp kan baterya sa manlaen-laen na potensyal (magpoon sa -110 mV) asin pagdagdag kan boltahe sa 5 mV na mga lakdang. An produksyon kan AP pigprobaran sa paagi nin pag-aplay nin depolarizing current. I-clamp an cell sa -70 mV mantang nag-aaplay nin depolarizing current pulse. I-adjust an sukol kan lakdang kan lambang yunit nin pagrekord nin separado (10 sagkod 60 pA). Karkulohon an pinakahalangkaw na AP frequency sa paagi nin mano-manong pagbilang kan mga pulse spike na nagigin dahelan kan pinakahalangkaw na AP frequency. An AP threshold inaanalisar sa paagi kan paggamit kan ikaduwang derivative kan depolarization pulse na enot na nag-trigger nin saro o labi pang APs.
Pag-configure asin pag-analisar kan may butas na patch. Maggibo nin perforated patch recording gamit an mga standard protocol. Maggamit nin ATP- asin GTP-free pipette na mayong laog kan minasunod na mga sangkap: 128 mM gluconate K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA asin 2 mM MgCl2, asin i-adjust sa pH 7.2 (gamit an KOH). An ATP asin GTP hinahale sa solusyon sa laog kan selula tanganing maibitaran an dai makontrol na pagkamaagi kan lamad kan selula. An patch pipette pinapano nin sarong panlaog na solusyon na igwa nin amphotericin (mga 200 sagkod 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) tanganing makakua nin rekord kan perforated patch. An Amphotericin tinunaw sa dimethyl sulfoxide (huring konsentrasyon: 0.1 sagkod 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). An konsentrasyon kan DMSO na ginamit mayo nin mahalagang epekto sa mga neuron na pinag-adalan. Sa proseso nin pagsuntok, an resistensya kan kanal (Ra) padagos na pigbabantayan, asin an eksperimento pinonan pagkatapos na an amplitude kan Ra asin AP nag-establisar (20-40 minutos). An kusang aktibidad sinusukol sa sarong boltahe asin/o kuryente na clamp sa laog nin 2 sagkod 5 minutos. An pag-analisar kan datos ginibo gamit an Igor Pro (bersyon 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (bersyon 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) asin GraphPad Prism (bersyon 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Estados Unidos). Tanganing mamidbid an mga spontaneous AP, an NeuroMatic v3.0c plug-in kan IgorPro ginagamit. Awtomatikong mamidbid an mga AP gamit an sarong itinaong threshold, na pig-aayos nin indibidwal para sa lambang rekord. Gamit an spike interval, aramon an spike frequency na may pinakahalangkaw na instantaneous spike frequency asin an average spike frequency.
PN pagbulag. Sa paagi nin pag-adaptar sa dati nang ipinublikar na protocol, an mga PN lininig gikan sa cerebellum kan mouse sa sarong espesipikong yugto (58). Sa halipot na pagtaram, an cerebellum pig-dissect asin pig-mince sa ice-cold dissociation medium [na mayong HBSS Ca2+ asin Mg2+, na pigdagdagan nin 20 mM glucose, penicillin (50 U/ml) asin streptomycin (0.05 mg/ ml)], dangan pig-digest an medium sa papain [HBSS, HC2+ na may supplementation steine (1 mg / ml), papain (16 U / ml) asin deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] Bulongon sa laog nin 30 minutos sa 30°C. Enot hugasan an mga tisyu sa HBSS medium na igwa nin egg mucus (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) asin DNase (0.1 mg/ml) sa temperatura kan kwarto tanganing maibitaran an enzymatic digestion, dangan sa HBSS medium na igwa nin 20 mM glucose Luway-luway na paggiling sa HBSS peillinic (10 mg/ml), strepcin (0.05 mg/ml) asin DNase (0.1 mg/ml) nagpapaluwas nin mga solong selula. An nagresultang suspensyon kan selula sinala sa paagi nin 70μm na salaan kan selula, dangan an mga selula pig-pellet sa paagi nin sentrifugasyon (1110 rpm, 5 minutos, 4°C) asin pig-resuspend sa sorting medium [HBSS, na pigdagdagan nin 20 mM glucose, 20% fetal bovine ) Serum, pelinic (50/5) asin stremcyn (0.05 mg/ml)]; ebalwaron an viability kan selula gamit an propidium iodide asin i-adjust an densidad kan selula sa 1×106 sagkod 2×106 cells/ml. Bago an flow cytometry, an suspension sinala sa paagi nin 50 μm na cell strainer.
Flow cytometer. An pag-sort kan selula ginibo sa 4°C gamit an FACSAria III machine (BD Biosciences) asin FACSDiva software (BD Biosciences, bersyon 8.0.1). An suspensyon kan selula pinag-urulay gamit an 100 μm na nozzle sa irarom nin presyon na 20 psi sa rikas na ~2800 na mga pangyayari/sec. Nin huli ta an tradisyonal na mga pamantayan sa pag-gate (sukol kan selula, bimodal na diskriminasyon, asin mga karakteristiko nin pagkalat) dai makakaseguro kan tamang pag-isolate kan PN gikan sa ibang klase nin selula, an estratehiya sa pag-gate itinalaga base sa direktang pagkumpara kan intensidad kan YFP asin autofluorescence sa mitoYFP+ ​​asin sa kontrol na mitoYFP − Mice. An YFP na-excite sa paagi nin pag-irradiate kan sample gamit an 488 nm na linya nin laser, asin an signal nadedetektaran gamit an 530/30 nm band pass filter. Sa mitoYFP+ ​​na mga ilaga, an relatibong kusog kan Rosa26-mitoYFP reporter gene ginagamit man tanganing mamidbid an neuronal body asin axon fragments. An 7-AAD na-excite gamit an 561 nm na yellow laser asin nadetektar gamit an 675/20 nm bandpass filter tanganing dai iiba an mga gadan na selula. Tanganing maseparar an mga astrocyte sa parehong oras, an suspensyon kan selula tinina nin ACSA-2-APC, dangan an sample pig-irradiate nin 640 nm na linya nin laser, asin an 660/20 nm na bandpass filter ginamit tanganing mahiling an signal.
An mga nakolekta na selula pig-pellet sa paagi nin centrifugation (1110 rpm, 5 minutos, 4°C) asin itinago sa -80°C sagkod na magamit. An mga Mfn2cKO na ilaga asin an saindang mga litter pups pigklasipikar sa parehong aldaw tanganing maibanan an pagkakaiba-iba kan prosedimiento. An pagpresentar asin pag-analisar kan datos kan FACS ginibo gamit an FlowJo software (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Siring sa nasambit sa itaas (59), an real-time PCR ginagamit sa pag-isolate kan DNA gikan sa mga pinag-urulay na mga neuron para sa kasunod na pagkwantipika kan mtDNA. An linearity asin threshold sensitivity enot na pigprobaran sa paagi nin pagpadalagan nin qPCR sa manlaen-laen na bilang nin mga selula. Sa halipot na tataramon, kolektahon an 300 PN sa sarong lysis buffer na igwa nin 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 asin proteinase K (200 ng/ml) asin i-incubate sa 55°C 120 minutos. An mga selula orog pang pig-inkubar sa 95°C sa laog nin 10 minutos tanganing maseguro an kumpletong pag-inaktibo kan proteinase K. Gamit an sarong TaqMan probe (Thermo Fisher) na espesipiko sa mt-Nd1, an mtDNA pigsukol sa paagi nin semi-quantitative PCR sa 7900HT Real-Time PCR system (Thermoherific Scientifics). Siyensya, numero nin katalogo Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, numero nin katalogo AIVI3E8) asin 18S (Thermo Fisher Scientific, numero nin katalogo Hs99999901_s1) na mga gene.
Pag-andam nin sampol nin proteome. Sa paagi nin pagpainit kan solusyon sa 95°C sa laog nin 10 minutos asin pag-sonicate, sa lysis buffer [6 M guanidine chloride, 10 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, 10 mM chloroacetamide asin 100 mM tris- Lyse frozen neuron pellets sa HC pellets]. Sa Bioruptor (Diagenode) sa laog nin 10 minutos (30 segundos na pulso / 30 segundos na panahon nin pag-ontok). An sample piglasaw nin 1:10 sa 20 mM tris-HCl (pH 8.0), pighalo sa 300 ng trypsin gold (Promega), asin pig-inkubar sa bilog na banggi sa 37°C tanganing makamtan an kumpletong pagtunaw. Sa ikaduwang aldaw, an sample pig-centrifuge sa 20,000 g sa laog nin 20 minutos. An supernatant piglasaw sa 0.1% na formic acid, asin an solusyon pig-desalt gamit an sadiring gibo na StageTips. An sample pinamara sa sarong instrumentong SpeedVac (Eppendorf concentrator plus 5305) sa 45°C, dangan an peptide pigsuspinde sa 0.1% na formic acid. An gabos na sample pinagpreparar nin sarabay kan parehong tawo. Tanganing ma-analisar an mga sampol nin astrocyte, 4 μg na desalted peptides an pigmarkahan nin tandem mass tag (TMT10plex, catalog number 90110, Thermo Fisher Scientific) na may peptide to TMT reagent ratio na 1:20. Para sa pagmarka kan TMT, 0.8 mg kan TMT reagent an pig-resuspend sa 70 μl kan anhydrous ACN, asin an pinatuyong peptide pig-reconstitute sa 9 μl kan 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate), na kun saen 7 μl kan TMT reagent sa ACN an idinagdag. An konsentrasyon 43.75%. Pakatapos nin 60 minutos nin pag-inkubar, an reaksyon pinarong gamit an 2 μl nin 5% hydroxylamine. An mga may marka na peptide tinipon, pinamara, pigsuspinde giraray sa 200μl nin 0.1% formic acid (FA), binaranga sa duwa, dangan pig-disalte gamit an self-made StageTips. Gamit an UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph), an saro sa duwang kabanga pig-fractionate sa sarong 1mm x 150mm Acquity chromatographic column na pano nin 130Å1.7μm C18 particles (Waters, catalog No SKU: 196366). Thermo Fisher Scientific). Iseparar an mga peptide sa flow rate na 30μl/min, iseparar poon 1% sagkod 50% buffer B sa laog nin 85 minutos na may stepwise gradient na 96 minutos, poon 50% sagkod 95% buffer B sa laog nin 3 minutos, dangan 8 minutos para sa 95 % Buffer B; An buffer A 5% ACN asin 10 mM ammonium bicarbonate (ABC), asin an buffer B 80% ACN asin 10 mM ABC. Magtipon nin mga fraction kada 3 minutos asin pagsararoon sinda sa duwang grupo (1 + 17, 2 + 18, asin iba pa) asin pamaraon sinda sa sarong vacuum centrifuge.
LC-MS/MS na pag-analisar. Para sa mass spectrometry, an mga peptide (numero r119.aq) pinagsuhay sa sarong 25 cm, 75 μm na panlaog na diametro na PicoFrit analytical column (bagong lente nin obheto, numero nin parte PF7508250) na igwa nin 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ medium (Maisch, Maisch-YAS), E. 1200 (Thermo Fisher Scientific, Germany). An kolum pinagdanay sa 50°C. An mga buffer A asin B 0.1% formic acid sa tubig asin 0.1% formic acid sa 80% ACN, sunod-sunod. An mga peptide pinagsuhay gamit an stepwise gradient na 200 nl/min poon 6% sagkod 31% buffer B sa laog nin 65 minutos, asin poon 31% sagkod 50% buffer B sa laog nin 5 minutos. An mga na-elute na peptide pig-analisar sa sarong Orbitrap Fusion mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). An pagsukol kan peptide precursor m/z ginigibo na may resolusyon na 120,000 sa rango nin 350 sagkod 1500 m/z. Gamit an 27% na normalisadong enerhiya nin banggaan, an pinakamatibay na prekursor na may estado nin karga na 2 sagkod 6 an pinili para sa halangkaw na enerhiyang C trap dissociation (HCD) cleavage. An oras kan siklo nakabugtak sa 1 s. An m/z na halaga kan peptide fragment sinusukol sa ion trap gamit an pinakasadit na target kan AGC na 5×104 asin an pinakahalangkaw na oras nin pag-ineksion na 86 ms. Pagkatapos kan pagkabaranga, an prekursor ibinugtak sa listahan nin dinamikong pag-eksklusibo sa laog nin 45 s. An mga peptide na may markang TMT pinagsuhay sa sarong 50 cm, 75 μm na kolum nin Acclaim PepMap (Thermo Fisher Scientific, numero nin katalogo 164942), asin an mga spectra nin paglipat pinag-analisar sa sarong Orbitrap Lumos Tribrid mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) na igwa nin high-field a ammetric iMS (IMS) an kagamitan (Thermo Fisher Scientific) nag-ooperar sa duwang boltahe nin kompensasyon na −50 asin −70 V. An MS3 na pinili base sa prekursor nin pag-synchronize ginagamit para sa pagsukol kan signal kan ion na report kan TMT. An pagbubulag kan peptide ginibo sa EASY-nLC 1200, gamit an 90% na linear gradient elution, na may konsentrasyon nin buffer na 6% sagkod 31%; an buffer A 0.1% FA, asin an buffer B 0.1% FA asin 80% ACN. An analitikal na kolum pigpapaandar sa 50°C. Gamiton an FreeStyle (bersyon 1.6, Thermo Fisher Scientific) tanganing bangaon an orihinal na file susog sa boltahe nin kompensasyon kan FAIMS.
Pagmidbid asin pagkwantipika kan protina. Gamit an pinagsararong Andromeda search engine, an orihinal na datos pig-analisar gamit an MaxQuant version 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Dugang pa sa Cre recombinase asin YFP sequences na nakua sa Aequorea victoria, an mga peptide fragment spectra hinanap para sa canonical sequence asin isoform sequence kan mouse reference proteome (Proteome ID UP000000589, na-download gikan sa UniProt kan Mayo 2017) . An methionine oxidation asin protein N-terminal acetylation pigbugtak bilang mga variable na modipikasyon; an cysteine ​​ficarbamoyl methylation itinalaga bilang mga nakapirming modipikasyon. An mga parametro sa pagtunaw nakabugtak sa "espesipiko" asin "trypsin/P". An pinakahababa na bilang kan mga peptide asin razor peptide na ginagamit para sa pagmidbid kan protina iyo an 1; an pinakahababa na bilang kan mga pambihirang peptide iyo an 0. Sa irarom kan mga kondisyon kan pagtutugma kan mapa kan peptide, an rate nin pagmidbid kan protina iyo an 0.01. An opsyon na "Ikaduwang Peptide" pinagana. Gamiton an opsyon na "match between runs" tanganing ibalyo an mga mapangganang pagmidbid sa pag-oltanan kan manlaen-laen na orihinal na mga file. Gamiton an LFQ minimum ratio count 1 para sa label-free quantification (LFQ) (60). An intensidad kan LFQ sinasala para sa dai mababa sa duwang balidong halaga sa dai mababa sa sarong grupo nin genotype sa lambang punto nin oras, asin pig-ekstrapolate gikan sa sarong normal na distribusyon na may lakbang na. 0.3 asin magbaba nin 1.8. Gamiton an Perseus computing platform (https://maxquant.net/perseus/) asin R (https://r-project.org/) tanganing analisaron an mga resulta kan LFQ. An duwang-paagi na katamtaman na t test gikan sa limma software package ginamit para sa differential expression analysis (61). An pag-analisar kan datos na eksplorasyon ginigibo gamit an ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally asin pheatmap. An datos kan proteomics na nakabase sa TMT pinag-analisar gamit an MaxQuant version 1.6.10.43. Maghanap nin hilaw na datos kan proteomics gikan sa database kan human proteomics kan UniProt, na na-download kan Setyembre 2018. An pag-analisar kabali an isotope purity correction factor na itinao kan paragibo. Gamiton an limma sa R ​​para sa pag-analisar kan pagkakaiba kan ekspresyon. An orihinal na datos, mga resulta kan paghanap sa database, asin an mga workflow asin resulta kan pag-analisar kan datos gabos nakatago sa ProteomeXchange alliance sa paagi kan PRIDE partner repository na may data set identifier na PXD019690.
An mga anotasyon sa pagpunsyon nagpapayaman kan pag-analisar. An Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) na kasangkapan ginamit tanganing determinaran an kayamanan kan mga termino nin functional annotation kan data set sa 8 na semana (Figure 1). Sa halipot na pagtaram, an quantitative protein list na nakua gikan sa LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) data analysis ginagamit sa minasunod na mga kriterya sa pagsala: An Mus musculus pinili bilang an species asin background, asin an kategorya nagpapahiling kan P value na pig-adjust ni Benjamini para sa enrichment 0.05 o mas hababa pigkokonsiderar na makahulogan. Para sa graph na ini, an limang pinakahalangkaw na sobrang kategorya sa lambang cluster base sa pig-adjust na P value ipinapahiling. Gamit an multiple t-test, gamit an duwang-yugto na linear boost program ni Benjamini, Krieger, asin Yekutieli (Q = 5%), an time-course protein expression analysis ginigibo sa mga importanteng kandidato na namidbid sa lambang kategorya, asin an lambang hilera inaanalisar nin separado. Dai kaipuhan na mag-ampon nin sarong padagos na SD.
Tanganing maikumpara an mga resulta kan pag-aadal na ini sa mga ipinublikar na database asin makagibo nin Venn diagram sa Figure 1, pinagsararo niamo an quantitative protein list sa MitoCarta 2.0 anotations (24). Gamiton an online tool na Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) tanganing makagibo nin diagram.
Para sa detalyadong impormasyon sa mga estadistikal na prosedimiento na ginagamit para sa pag-analisar kan proteomics, hilingon an katumbas na seksyon kan mga Materyales asin Paagi. Para sa gabos na iba pang eksperimento, an detalyadong impormasyon makukua sa katumbas na alamat. Apwera kun iba an sinasabi, an gabos na datos ipinapahayag bilang mean ± SEM, asin an gabos na estadistikal na pag-analisar ginibo gamit an GraphPad Prism 8.1.2 software.
Para sa mga dagdag na materyales para sa artikulong ini, hilingon an http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Ini sarong open access na artikulo na ipinapanao sa irarom kan mga termino kan Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, na nagtutugot kan paggamit, distribusyon asin reproduksyon sa arin man na medium, basta an pinal na paggamit bakong para sa komersyal na ganansya asin an premisa iyo na an orihinal na obra tama. Reperensiya.
Tandaan: Hinahagad mi sana saimo na itao mo an saimong email address tanganing maaraman kan tawong saimong irinerekomendar sa page na gusto mong mahiling ninda an email asin na bako ining spam. Dai kami makakakua nin anuman na mga email address.
An hapot na ini ginagamit tanganing maprobaran kun ika sarong bisita asin maibitaran an awtomatikong pagsusumite nin spam.
Ni E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
An pag-analisar kan proteomics kan mga neuron na dai nagpupunsionar nagbuyagyag na an mga programa sa metabolismo inaaktibo tanganing kontrahon an neurodegeneration.
Ni E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
An pag-analisar kan proteomics kan mga neuron na dai nagpupunsionar nagbuyagyag na an mga programa sa metabolismo inaaktibo tanganing kontrahon an neurodegeneration.
©2020 American Association for the Advancement of Science. gabos na deretso reserbado. An AAAS sarong partner kan HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef asin COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.