An artikulo parte kan temang pagsiyasat na "Pagpauswag kan resistensya kan mga legume sa mga pathogen asin peste", hilingon an gabos na 5 artikulo
An dahelan kan fungal plant disease necrosis Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary naggagamit nin multi-tiered na estratehiya tanganing maulakitan an manlaen-laen na tinanom na host. An pag-aadal na ini nagproponer kan paggamit kan diamine L-ornithine, sarong bakong protina na amino acid na nagpupukaw kan paggibo nin iba pang mga mahalagang amino acid, bilang sarong alternatibong estratehiya sa pagdumara tanganing mapakarhay an molekular, pisyolohikal asin biokemikal na mga simbag kan Phaseolus vulgaris L. sa puting amag na kawsa kan Pseudomonasclerum sclerum. An mga eksperimento sa vitro nagpahiling na an L-ornithine makahulogan na nakapugol sa pagtalubo kan mycelial kan S. pyrenoidosa sa paaging nakadepende sa dosis. Dugang pa, ini makakabawas nin dakula sa grabe kan puting amag sa irarom kan mga kondisyon sa greenhouse. Dugang pa, an L-ornithine nagpukaw kan pagtalubo kan mga tinanom na tinatrato, na nagpapahiling na an mga pigprobaran na konsentrasyon kan L-ornithine bakong phytotoxic sa mga tinanom na tinatrato. Dugang pa, an L-ornithine nagpauswag kan ekspresyon kan mga non-enzymatic antioxidants (total soluble phenolics asin flavonoids) asin enzymatic antioxidants (catalase (CAT), peroxidase (POX), asin polyphenol oxidase (PPO)), asin nagpauswag kan ekspresyon kan tolong antioxidant-related genes (PSO1, PVGRAT, asin PAVD). Dugang pa, an pag-analisar sa silico naghayag kan presensya nin sarong putative oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) na protina sa genome kan S. sclerotiorum, na kapareho nanggad kan oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) na mga protina kan Aspergillus fijiensis (AfOAH) asin Penicillium Penicillium. (PlOAH) sa mga termino nin pag-analisar kan pagpunsyon, mga konserbadong domain, asin topolohiya. Interesante, an pagdagdag kan L-ornithine sa potato dextrose broth (PDB) na medium nakabawas na gayo kan ekspresyon kan SsOAH gene sa S. sclerotiorum mycelia. Siring man, an exogenous na aplikasyon kan L-ornithine nakabawas na gayo kan ekspresyon kan SsOAH gene sa fungal mycelia na nakolekta gikan sa mga tinanom na tinatrato. Sa katapustapusi, an aplikasyon nin L-ornithine nakabawas na marhay sa pagluwas nin oxalic acid sa parehong PDB medium asin mga naulakitan na dahon. Sa konklusyon, an L-ornithine igwa nin pangenot na papel sa pagmantenir kan redox status siring man sa pagpapauswag kan depensa kan mga naulakitan na tinanom. An mga resulta kan pag-aadal na ini puedeng makatabang sa paggibo nin mga makabagong, bakong makaraot sa kapalibutan na mga paagi tanganing makontrol an puting amag asin maibsan an epekto kaini sa produksyon nin pisog asin iba pang mga pananom.
An puting amag, na kawsa kan necrotrophic fungus na Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, sarong nakakaraot, nakakabawas nin ani na helang na nagdudulot nin seryosong peligro sa pankinaban na produksyon nin pisog (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). An Sclerotinia sclerotiorum saro sa mga pinakamasakit na kontrolon na mga pathogen kan fungal na tinanom na dara sa daga, na may mahiwas na hanay nin host na labing 600 na klase nin tinanom asin an kakayahan na marikas na mag-macerate kan mga tisyu kan host sa sarong bakong espesipikong paagi (Liang asin Rollins, 2018). Sa irarom nin bakong paborableng mga kondisyon, ini nag-aagi nin sarong kritikal na yugto kan saiyang siklo nin buhay, na nagdadanay na dai naghihiro sa halawig na panahon bilang itom, matagas, garo banhi na mga estruktura na inaapod na 'sclerotia' sa daga o bilang puti, malambot na mga pagtubo sa mycelium o stem pith kan mga naulakitan na tinanom (Schwartz et al., 2005). An S. sclerotiorum kayang magbilog nin sclerotia, na nagtutugot kaini na mabuhay sa mga naulakitan na natad sa halawig na panahon asin magdanay sa panahon nin helang (Schwartz et al., 2005). An Sclerotia mayaman sa sustansya, pwedeng magdanay sa daga sa halawig na panahon, asin nagseserbing primerong inoculum para sa mga masunod na impeksyon (Schwartz et al., 2005). Sa irarom kan paborableng kondisyon, an sclerotia nagtutubo asin nagpoprodusir nin mga spore na nasa aire na pwedeng makaulakit sa gabos na parte kan tinanom sa itaas kan daga, kabali alagad bakong limitado sa mga burak, mga gamot, o mga pisog (Schwartz et al., 2005).
An Sclerotinia sclerotiorum naggagamit nin multi-tiered na estratehiya tanganing maulakitan an mga tinanom na host kaini, na imbuelto an serye nin mga koordinadong pangyayari poon sa pagturubo kan sclerotial sagkod sa pag-uswag kan sintomas. Sa primero, an S. sclerotiorum nagpoprodusir nin mga nakabitin na spore (na inaapod na ascospores) gikan sa mga estrukturang garo uhong na inaapod na apothecia, na nagigin airborne asin nagigin non-motile sclerotia sa mga naulakitan na basura nin tinanom (Bolton et al., 2006). An fungus dangan nagpapaluwas nin oxalic acid, sarong virulence factor, tanganing makontrol an pH kan lanob kan selula kan tinanom, mapauswag an enzymatic degradation asin tissue invasion (Hegedus asin Rimmer, 2005), asin mapugulan an oxidative burst kan host plant. An prosesong ini nin pag-asido nagpapaluya kan lanob kan selula kan tinanom, na nagtatao nin paborableng kapalibutan para sa normal asin episyente na operasyon kan mga fungal cell wall degrading enzymes (CWDEs), na nagtutugot sa pathogen na malampasan an pisikal na ulang asin makalaog sa mga tisyu kan host (Marciano et al., 1983). Kun nalaog na, an S. sclerotiorum nagpapaluwas nin nagkapirang CWDE, arog kan polygalacturonase asin cellulase, na nagpapadali kan paglakop kaini sa mga naulakitan na tisyu asin nagigin dahelan nin tissue necrosis. An pag-uswag kan mga lugad asin mga hyphal mats nagdadara sa mga karakteristikong sintomas kan puting amag (Hegedus asin Rimmer, 2005). Mientrastanto, an mga tinanom na host namimidbid an mga molekular na pattern na may relasyon sa pathogen (PAMPs) sa paagi nin mga pattern recognition receptor (PRRs), na nagpupukaw nin serye nin mga pangyayari sa pagsenyas na sa katapustapusi nag-aaktibo kan mga simbag sa depensa.
Sa ibong kan mga dekada nin mga paghihingoa sa pagkontrol kan helang, an mga kakulangan nin supisyenteng resistenteng germplasm nagdadanay sa pisog, arog kan ibang mga komersyal na pananom, huli sa resistensya, survival, asin adaptability kan pathogen. An pagmanehar kan helang kun kaya labi-labi an angat asin nangangaipo nin sarong pinagsararo, multifaceted na estratehiya na kabali an kombinasyon nin mga gawi sa kultura, pagkontrol biyolohikal, asin mga kemikal na fungicide (O'Sullivan et al., 2021). An kemikal na pagkontrol kan puting amag iyo an pinakaepektibo huli ta an mga fungicide, kun pig-aaplay nin tama asin sa tamang panahon, epektibo na makontrol an paglakop kan helang, mabawasan an grabe kan impeksyon, asin mabawasan an pagkawara kan ani. Alagad, an sobrang paggamit asin sobrang pagsarig sa mga fungicide puedeng magresulta sa pagluwas nin mga resistensyadong strain kan S. sclerotiorum asin negatibong makaapektar sa mga bakong target na organismo, salud kan daga, asin kalidad kan tubig (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Kaya, an paghanap nin mga alternatibong bakong makaraot sa kapalibutan nagin nang pangenot na prayoridad.
An mga polyamine (PAs), arog kan putrescine, spermidine, spermine, asin cadaverine, pwedeng magserbing mga alternatibong may panuga laban sa mga pathogen kan tinanom na dara kan daga, sa siring lubos o parsyal na nabawasan an paggamit nin mga peligrosong kemikal na fungicide (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Sa mas halangkaw na mga tinanom, an mga PA imbuelto sa kadakol na proseso nin pisyolohiya kabali, alagad bakong limitado sa, pagbaranga kan selula, pagdibersipika, asin pagsimbag sa mga abiotiko asin biotikong mga stress (Killiny asin Nehela, 2020). Pwede sindang mag-akto bilang mga antioxidant, makatabang sa pag-agaw nin mga reactive oxygen species (ROS), magmantenir nin redox homeostasis (Nehela asin Killiny, 2023), mag-induce nin mga gene na may relasyon sa depensa (Romero et al., 2018), magregulate nin manlaen-laen na metabolikong agihan (Nehela asin Killiny, 2023), magmodulate nin mga enhorgenous asin enhorgenous (Nehela asin Killiny, 2023). Killiny, 2019), magbugtak nin systemic acquired resistance (SAR), asin magregulate kan mga interaksiyon kan tinanom-pathogen (Nehela asin Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Mahalagang mangnohon na an mga partikular na mekanismo asin papel kan mga PA sa depensa kan tinanom nagkakaiba-iba depende sa mga klase nin tinanom, mga pathogen, asin mga kondisyon kan kapalibutan. An pinakadakol na PA sa mga tinanom iyo an biosynthesize gikan sa mahalagang polyamine L-ornithine (Killiny asin Nehela, 2020).
An L-ornithine igwa nin manlaen-laen na papel sa pagtalubo asin pag-uswag kan tinanom. Halimbawa, an mga nakaaging pag-aadal nagpahiling na sa bagas (Oryza sativa), an ornithine pwedeng may koneksyon sa pag-recycle kan nitroheno (Liu et al., 2018), ani nin paroy, kalidad asin aroma (Lu et al., 2020), asin pagresponde sa stress sa tubig (Yang et al., 2000). Dugang pa, an exogenous na aplikasyon kan L-ornithine makahulogan na nagpauswag kan pagtolerar sa tigmara sa sugar beet (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) asin nakabawas sa tension sa asin sa sibulyas (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu asin Çavuşoǧlu, 2021) asin cashena (Awccidale) na tinanom Rocha et al., 2012). An potensyal na papel kan L-ornithine sa depensa sa abiotic stress pwedeng huli sa pakikilabot kaini sa pagtipon nin proline sa mga tinanom na tinatratar. Halimbawa, an mga gene na may relasyon sa metabolismo kan proline, arog kan ornithine delta aminotransferase (delta-OAT) asin proline dehydrogenase (ProDH1 asin ProDH2) na mga gene, dati nang naibareta na imbuelto sa depensa kan Nicotiana benthamiana asin Arabidopsis thaliana laban sa mga non-host Pseudomonas strains (Kumare, asin Mysoreh 2012). Sa ibong na lado, an fungal ornithine decarboxylase (ODC) kaipuhan para sa pagtalubo kan pathogen (Singh et al., 2020). Pagpuntirya sa ODC kan Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici sa paagi kan host-induced gene silencing (HIGS) nagpauswag na gayo kan resistensya kan mga tinanom na kamatis sa Fusarium wilt (Singh et al., 2020). Alagad, an potensyal na papel kan aplikasyon kan exogenous ornithine laban sa mga biotic stress arog kan mga phytopathogens dai pa napag-adalan nin marhay. An mas mahalaga, an mga epekto kan ornithine sa resistensya sa helang asin an mga kaugnay na biokemikal asin pisyolohikal na mga pangyayari nagdadanay na dai pa napag-aadalan.
An pagsabot kan komplikado kan impeksyon kan S. sclerotiorum sa mga legume importante para sa paggibo nin epektibong mga estratehiya sa pagkontrol. Sa pag-aadal na ini, an samong katuyuhan iyo na mamidbid an potensyal na papel kan diamine L-ornithine bilang sarong pangenot na bagay sa pagpapauswag kan mga mekanismo nin depensa asin resistensya kan mga tinanom na legume sa impeksyon kan Sclerotinia sclerotiorum. Kami nag-iisip na, dugang pa sa pagpapauswag kan mga simbag sa depensa kan mga naulakitan na tinanom, an L-ornithine igwa man nin pangenot na papel sa pagmantenir kan estado nin redox. Ipigproponer niamo na an mga potensyal na epekto kan L-ornithine may relasyon sa regulasyon kan mga mekanismo nin depensa kan enzymatic asin non-enzymatic antioxidant asin interbensyon sa mga fungal pathogenicity/virulence factors asin mga kaugnay na protina. An duwang pagpunsyonar na ini kan L-ornithine ginigibo ining sarong promising na kandidato para sa sarong sustenableng estratehiya tanganing maibsan an epekto kan puting amag asin mapakarhay an resistensya kan mga komun na pananom na legume sa mapuersang fungal pathogen na ini. An mga resulta kan presenteng pag-aadal puedeng makatabang sa paggibo nin mga makabagong, makikatood sa kapalibutan na mga paagi tanganing makontrol an puting amag asin maibsan an epekto kaini sa produksyon nin mga legume.
Sa pag-aadal na ini, sarong madaling mabiktima na komersyal na klase nin komun na pisog, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), an ginamit bilang eksperimentong materyal. An mga marahay na banhi maboot na itinao kan Legume Research Department, Field Crops Research Institute (FCRI), Agricultural Research Center (ARC), Ehipto. Limang banhi an isinabwag sa mga plastik na kaldero (panlaog na diametro 35 cm, rarom 50 cm) na pano nin daga na may impeksyon nin S. sclerotiorum sa irarom kan mga kondisyon nin greenhouse (25 ± 2 °C, relatibong kahamutan 75 ± 1%, 8 h na liwanag/16 h na diklom). Sa 7-10 aldaw pagkatapos kan pagsabwag (DPS), an mga semilya pinanipis tanganing magwalat sana nin duwang semilya na may unipormeng pagtalubo asin tolong lubos na pinahiwas na dahon sa lambang kaldero. An gabos na tinanom sa kaldero binaribihan nin sarong beses kada duwang semana asin pig-abonohan bulan-bulan sa rekomendadong rate para sa itinaong klase.
Tanganing makaandam nin 500 mg/L na konsentrasyon nin L-ornithinediamine (na midbid man bilang (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany), 50 mg an enot na tinunaw sa 100 mL nin sterile distilled water. An stock solution dangan piglasaw asin ginamit sa mga suminunod na eksperimento. Sa halipot na panahon, anom na serye nin mga konsentrasyon nin L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100, asin 125 mg/L) an pigtesting sa vitro. Dugang pa, an sterile distilled water ginamit bilang negatibong kontrol (Mock) asin an komersyal na fungicide na “Rizolex-T” 50% wettable powder (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Egy) ginamit bilang positibong kontrol. An komersyal na fungicide na "Rizolex-T" pigtestingan sa vitro sa limang konsentrasyon (2, 4, 6, 8 asin 10 mg/L).
An mga sampol kan mga komun na gamot asin mga pod nin pisog na nagpapahiling nin tipikal na mga sintomas nin puting amag (infestation rate: 10–30%) tinipon sa mga komersyal na oma. Dawa ngani an kadaklan sa mga naulakitan na materyales nin tinanom nabisto sa paagi nin mga klase/klase (na madaling mabiktima na komersyal na klase na Giza 3), an iba, orog na idtong mga nakua sa lokal na mga merkado, mga dai aram na klase. An mga nakolekta na mga materyales na may impeksyon enot na pigdisinpekta sa ibabaw gamit an 0.5% na solusyon nin sodium hypochlorite sa laog nin 3 minutos, dangan hinugasan nin nagkapirang beses gamit an sterile distilled water asin pinunasan nin sterile filter paper tanganing mahale an sobrang tubig. An mga naulakitan na organo dangan pinutol sa saradit na pidaso gikan sa tahaw na tisyu (sa pag-ultanan kan mga marahay asin naulakitan na tisyu), pigkultibar sa potato dextrose agar (PDA) medium asin pig-inkubar sa 25 ± 2 °C na may 12 h na liwanag/12 h na diklom na siklo sa laog nin 5 aldaw tanganing pukawon an pagporma nin sclerotia. An mycelial tip method ginamit man sa paglinig kan mga fungal isolates gikan sa mga pinaghalo o kontaminadong kultura. An pinadalisay na fungal isolate enot na namidbid base sa mga karakteristiko kan morpolohiya kaini sa kultura asin dangan kinumpirmar na S. sclerotiorum base sa mga mikroskopikong tampok. Sa katapustapusi, an gabos na pinadalisay na mga isolate pigtestingan para sa pathogenicity sa madaling mabiktima na komun na cultivar nin pisog na Giza 3 tanganing maabot an mga postulate ni Koch.
Dugang pa, an pinaka-invasive na S. sclerotiorum isolate (isolate #3) orog pang nakumpirma base sa internal transcribed spacer (ITS) sequencing siring sa ipinaliwanag ni White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Sa halipot na panahon, an mga isolate pigkultibar sa potato dextrose broth (PDB) asin pig-inkubar sa 25 ± 2 °C sa laog nin 5-7 aldaw. An fungal mycelium dangan tinipon, sinala sa paagi nin cheesecloth, hinugasan nin duwang beses gamit an sterile na tubig, asin pinamara gamit an sterile filter paper. An genomic DNA pig-isolate gamit an Quick-DNATM Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). An rehiyon kan ITS rDNA dangan pig-amplify gamit an espesipikong primer pair na ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; piglalaoman na kadakulaan: 540 bp) ( Baturo-Ciesniewska et al., 2017 ). An mga pinadalisay na produkto kan PCR isinumiter para sa pagsunod-sunod (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). An mga pagkasunod-sunod kan ITS rDNA pinagsunod-sunod sa duwang direksyon gamit an paagi nin pagsunod-sunod kan Sanger. An mga pinagsararong mga pagkasunod-sunod nin mga kahaputan dangan pigkumpara sa pinakabagong datos sa GenBank asin sa National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) gamit an BLASTn software. An pagkasunod-sunod kan mga kahaputan pigkumpara sa 20 iba pang mga strain/isolate kan S. sclerotiorum na nakua gikan sa pinakabagong datos sa NCBI GenBank (Supplementary Table S1) gamit an ClustalW sa Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; bersyon 11) (Kumar et al., 2024). An pag-analisar kan ebolusyon ginibo gamit an paagi nin pinakahalangkaw na posibilidad asin an pangkagabsan na modelo nin pagsalida nin nukleotide na nabababalik sa panahon (Nei asin Kumar, 2000). An kahoy na may pinakahalangkaw na log-likelihood ipinapahiling. An enot na kahoy para sa heuristic search pinipili sa paagi nin pagpili kan kahoy na may mas halangkaw na log-likelihood sa pag-ultanan kan neighbor-joining (NJ) tree (Kumar et al., 2024) asin an maximum parsimony (MP) tree. An NJ tree pigkonstruhir gamit an sarong pairwise distance matrix na kinarkulo gamit an pangkagabsan na time-reversible model (Nei asin Kumar, 2000).
An antibacterial na aktibidad kan L-ornithine asin an bactericide na "Rizolex-T" nadeterminaran sa vitro sa paagi kan agar diffusion method. Paagi: Kuanon an tamang kantidad kan stock solution kan L-ornithine (500 mg/L) asin ihalo ini nin marhay sa 10 ml kan PDA nutrient medium tanganing mag-andam nin mga solusyon na may pinal na konsentrasyon na 12.5, 25, 50, 75, 100 asin 125 mg/L, sunod-sunod. Limang konsentrasyon kan fungicide na "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 asin 10 mg/L) asin sterile distilled water an ginamit bilang kontrol. Pagkatapos na an medium nagsolidify, an sarong bagong inandam na mycelial plug kan Sclerotinia sclerotiorum culture, 4 mm an diametro, ibinalyo sa sentro kan Petri dish asin pigkultibar sa 25±2°C sagkod na an mycelium matahoban an bilog na control Petri dish, pagkatapos kaini an pagtalubo kan fungi naitala. Karkulohon an porsyento nin pagpugol kan radial na pagtalubo kan S. sclerotiorum gamit an ekwasyon 1:
An eksperimento inutro nin duwang beses, na may anom na biyolohikong replika para sa lambang kontrol/eksperimental na grupo asin limang kaldero (duwang tinanom kada kaldero) para sa lambang biyolohikong replika. An lambang biyolohikong replika pinag-analisar nin duwang beses (duwang teknikal na replika) tanganing maseguro an pagkaeksakto, pagkamasasarigan asin pagkareprodusir kan mga resulta kan eksperimento. Dugang pa, an pag-analisar kan probit regression ginamit tanganing makalkulo an half-maximal inhibitory concentration (IC50) asin IC99 (Prentice, 1976).
Tanganing ma-ebalwar an potensyal kan L-ornithine sa irarom kan mga kondisyon kan greenhouse, duwang magkasunod na eksperimento sa kaldero an ginibo. Sa halipot na panahon, an mga kaldero pinano nin isterilisadong daga na clay-sand (3:1) asin pigbakunahan nin bagong inandam na kultura kan S. sclerotiorum. Enot, an pinaka-invasive na isolate kan S. sclerotiorum (isolate #3) pigkultibar sa paagi nin pagputol nin sarong sclerotium sa kabanga, na ibinugtak ini na nakaatubang sa sarong PDA asin pig-inkubar sa 25°C sa danay na diklom (24 h) sa laog nin 4 na aldaw tanganing pukawon an pagtalubo kan mycelial. Apat na 5 mm na diametro na agar plugs an kinua sa nangengenot na gilid asin pig-inokular nin 100 g nin sarong sterile na pinaghalo nin trigo asin rice bran (1:1, v/v) asin an gabos na flask pig-inkubar sa 25 ± 2 °C sa irarom nin 12 h light/12 h dark cycle sa laog nin 5 aldaw tanganing ma-stimulate an sclerotia formation. An laog kan gabos na flask pinaghalo nin marhay tanganing maseguro an pagkakapareho bago magdagdag nin daga. Dangan, 100 g kan pinaghalo na bran na nagkolonya an idinagdag sa lambang kaldero tanganing maseguro an danay na konsentrasyon nin mga pathogen. An mga inokuladong kaldero pinatubigan tanganing ma-aktibo an pagtalubo kan fungi asin ibinugtak sa mga kondisyon nin greenhouse sa laog nin 7 aldaw.
Limang pisog kan Giza 3 na klase an isinabwag sa lambang kaldero. Para sa mga kaldero na tinatrato nin L-ornithine asin kan fungicide na Rizolex-T, an mga na-sterilize na banhi enot na binabad sa laog nin duwang oras sa sarong tubigon na solusyon kan duwang compound na may huring konsentrasyon kan IC99 na mga 250 mg/L asin 50 mg/L, sunod-sunod, dangan pinamara sa aire sa laog nin sarong oras bago magsabwag. Sa ibong na lado, an mga pisog ibinabad sa sterile distilled water bilang negatibong kontrol. Pakalihis nin 10 aldaw, bago an enot na pagtubig, an mga semilya pinanipis, na nawalat sana an duwang malinig na semilya sa kada kaldero. Dugang pa, tanganing maseguro an impeksyon sa S. sclerotiorum, an mga gamot kan tinanom na pisog sa parehong yugto nin pag-uswag (10 aldaw) pinutol sa duwang magkaibang lokasyon gamit an sarong sterilized scalpel asin mga 0.5 g kan pinaghalo na bran na nagkolonya an ibinugtak sa lambang lugad, na sinundan nin halangkaw na humidity tanganing pukawon an impeksyon asin naulakitan na pag-uswag kan gabos na tinanom. An mga tinanom na kontrol parehong nalugadan asin an pantay na kantidad (0.5 g) nin sterile, dai nakolonisadong pinaghalo na bran ibinugtak sa lugad asin pinagdanay sa irarom nin halangkaw na kahamutan tanganing i-simulate an kapalibutan para sa pag-uswag kan helang asin maseguro an pagkakapareho sa pag-ultanan kan mga grupo nin pagbolong.
Paagi nin pagbolong: An mga semilya nin pisog pinatubigan nin 500 ml nin tubigon na solusyon nin L-ornithine (250 mg/l) o an fungicide na Rizolex-T (50 mg/l) sa paagi nin patubig kan daga, dangan an pagbolong inutro nin tolong beses sa lakdang na 10 aldaw. An mga kontrol na tinawan nin placebo pinatubigan nin 500 ml nin sterile distilled water. An gabos na pagbolong ginibo sa irarom nin mga kondisyon nin greenhouse (25 ± 2°C, 75 ± 1% relatibong humidity, asin sarong photoperiod na 8 h liwanag/16 h diklom). An gabos na kaldero binaribihan kada duwang semana asin tinatrato bulanan nin balanseng abono na NPK (20-20-20, na may 3.6% na asupre asin TE microelements; Zain Seeds, Egypt) sa konsentrasyon na 3–4 g/l sa paagi nin foliar spraying susog sa mga rekomendasyon para sa partikular na klase asin mga instruksyon kan paggibo. Apwera kun iba an sinabi, an mga lubos na pinahiwas na mga dahon (ika-2 asin ika-3 na dahon gikan sa itaas) tinipon gikan sa lambang biyolohikong replika sa 72 h pagkatapos kan pagbolong (hpt), pinag-homogenize, pinagsararo asin itinago sa -80 °C para sa dugang pang mga pag-analisar kabali, alagad bakong limitado sa, in situ histochemical localization kan mga indikasyon nin oxidative stress, peroxidatic peromatic asin enzymatic mga non-enzymatic antioxidants asin gene expression.
An intensidad kan impeksyon sa puting amag pig-assess kada semana 21 aldaw pagkatapos kan inokulasyon (dpi) gamit an sarong eskala na 1-9 (Supplementary Table S2) base sa Petzoldt asin Dickson scale (1996) na binago ni Teran et al. (2006). Sa halipot na panahon, an mga gamot asin sanga kan mga tinanom na pisog pig-eksamin poon sa punto nin pagbakuna tanganing masundan an pag-uswag kan mga lugad sa mga internode asin node. An distansya kan lugad poon sa punto nin pagbakuna sagkod sa pinakaharayong punto sa kahalabaan kan lindog o sanga dangan sinukol asin an marka na 1-9 itinao base sa lokasyon kan lugad, kun saen (1) nagpapahiling na mayo nin nahihiling na impeksyon harani sa punto nin pagbakuna asin (2-9) nagpapahiling nin luway-luway na paglangkaw kan kadakulaan kan lugad asin pag-uswag sa kahalabaan kan mga node/Snode/Snodes (Snode S2). An intensidad kan impeksyon sa puting amag dangan pigkombertir sa porsyento gamit an pormula 2:
Dugang pa, an lugar sa irarom kan kurba nin pag-uswag kan helang (AUDPC) kinarkulo gamit an pormula (Shaner asin Finney, 1977), na dai pa sana nahahaloy na inadaptar para sa puting pagkabulok kan komun na pisog (Chauhan et al., 2020) gamit an ekwasyon 3:
Kun saen Yi = grabe kan helang sa oras na ti, Yi+1 = grabe kan helang sa sunod na oras ti+1, ti = oras kan enot na pagsukol (sa mga aldaw), ti+1 = oras kan sunod na pagsukol (sa mga aldaw), n = total na bilang kan mga punto nin oras o mga punto nin pag-obserbar. An mga parametro kan pagtalubo kan tinanom na pisog kabali an langkaw kan tinanom (cm), bilang kan mga sanga kada tinanom, asin bilang kan mga dahon kada tinanom itinala kada semana sa laog nin 21 aldaw sa gabos na biyolohikong replika.
Sa lambang biyolohikong replika, an mga sampol nin dahon (ikaduwa asin ikatolong lubos nang natalubo na dahon gikan sa itaas) tinipon sa ika-45 aldaw pagkatapos kan pagbolong (15 aldaw pagkatapos kan huring pagbolong). An lambang biyolohikong replika igwa nin limang kaldero (duwang tinanom kada kaldero). Mga 500 mg kan rinaot na tisyu an ginamit para sa pagkua nin mga pigment na photosynthetic (chlorophyll a, chlorophyll b asin carotenoids) gamit an 80% na acetone sa 4 °C sa diklom. Pakalihis nin 24 h, an mga sample pig-centrifuge asin an supernatant tinipon para sa pagdeterminar kan mga laog kan chlorophyll a, chlorophyll b asin carotenoid sa paagi nin kolorimetriko gamit an UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan) susog sa paagi kan (Lichtenthaler, 1987) sa paagi nin pagsukol kan pagsupsop sa manlaen-laen na laba nin alon (A470, A646 asin A663 nm). Sa katapustapusi, an laog kan mga pigment na photosynthetic kinarkulo gamit an minasunod na mga pormula 4-6 na ilinadawan ni Lichtenthaler (1987).
Sa 72 h pagkatapos kan pagbolong (hpt), an mga dahon (ikaduwa asin ikatolong lubos nang nagtalubo na dahon gikan sa itaas) tinipon gikan sa lambang biyolohikal na replika para sa in situ histochemical localization kan hydrogen peroxide (H2O2) asin superoxide anion (O2•−). An lambang biyolohikong replika igwa nin limang kaldero (duwang tinanom kada kaldero). An lambang biyolohikong replika pig-analisar sa doble (duwang teknikal na replika) tanganing maseguro an pagkaeksakto, pagkamasasarigan asin pagkareprodusir kan paagi. An H2O2 asin O2•− nadeterminaran gamit an 0.1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) o nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany), sunod-sunod, susog sa mga paagi na ilinadawan ni Romero-Puertas et al. (2004) asin Adam et al. (1989) na may saradit na pagbabago. Para sa histochemical localization kan H2O2 sa lugar, an mga leaflet pig-infiltrate sa vacuum na may 0.1% DAB sa 10 mM Tris buffer (pH 7.8) dangan pig-inkubar sa temperatura kan kwarto sa liwanag sa laog nin 60 min. An mga leaflet pinaputi sa 0.15% (v/v) TCA sa 4:1 (v/v) ethanol:chloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) dangan ibinuyagyag sa liwanag sagkod na sinda magdiklom. Siring man, an mga balbula pig-infiltrate nin vacuum na may 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.8) na igwa nin 0.1 w/v % HBT para sa histochemical localisation kan O2•− sa lugar. An mga leaflet pig-inkubar sa liwanag sa temperatura kan kwarto sa laog nin 20 min, dangan pinaputi arog kan nasa itaas, dangan pig-iilaw sagkod na maglataw an maitom na asul/violet na mga laad. An intensidad kan nagresultang kayumanggi (bilang sarong indikasyon kan H2O2) o asul-violet (bilang sarong indikasyon kan O2•−) na kolor pig-assess gamit an bersyon kan Fiji kan pakete sa pagproseso nin imahe na ImageJ (http://fiji.sc; na-access kan 7 Marso 2024).
An Malondialdehyde (MDA; bilang sarong marker kan lipid peroxidation) nadeterminaran susog sa paagi ni Du asin Bramlage (1992) na may dikit na mga modipikasyon. An mga dahon gikan sa lambang biyolohikong replika (ikaduwa asin ikatolong lubos nang natalubo na mga dahon gikan sa itaas) tinipon 72 h pagkatapos kan pagbolong (hpt). An lambang biolohikong replika igwa nin limang kaldero (duwang tinanom kada kaldero). An lambang biyolohikong replika pig-analisar sa doble (duwang teknikal na replika) tanganing maseguro an pagkaeksakto, pagkamasasarigan asin pagkareprodusir kan paagi. Sa halipot na panahon, 0.5 g kan tisyu kan dahon na giniling an ginamit para sa pagkua nin MDA na may 20% trichloroacetic acid (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) na igwa nin 0.01% butylated hydroxytoluene (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). An laog kan MDA sa supernatant dangan nadeterminaran sa paagi nin pagsukol kan absorbance sa 532 asin 600 nm gamit an UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan) asin dangan ipinahayag bilang nmol g−1 FW.
Para sa pag-assess kan mga non-enzymatic asin enzymatic na mga antioxidant, an mga dahon (ikaduwa asin ikatolong lubos nang natalubo na mga dahon gikan sa itaas) tinipon gikan sa lambang biyolohikong replika sa 72 h pagkatapos kan pagbolong (hpt). An lambang biyolohikong replika igwa nin limang kaldero (duwang tinanom kada kaldero). An lambang biolohikong sampol pig-analisar sa doble (duwang teknikal na sampol). Duwang dahon an giniling gamit an likidong nitroheno asin ginamit nin direkta para sa pagdeterminar kan mga enzymatic asin non-enzymatic na mga antioxidant, total na amino acid, laog nin proline, ekspresyon kan gene, asin pagkwantipika kan oxalate.
An total na mga soluble phenolics nadeterminaran gamit an Folin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) na may dikit na mga modipikasyon kan paagi na ilinadawan ni Kahkonen et al. (1999). Sa halipot na panahon, mga 0.1 g kan homogenized leaf tissue an kinua gamit an 20 ml 80% methanol sa diklom sa laog nin 24 h asin an supernatant tinipon pagkatapos kan centrifugation. 0.1 ml kan sample extract pighalo sa 0.5 ml na Folin-Ciocalteu reagent (10%), pigyugyog sa laog nin 30 s asin pinabayaan sa diklom sa laog nin 5 min. Dangan 0.5 ml kan 20% na solusyon nin sodium carbonate (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egypt) an idinagdag sa lambang tubo, pinaghalo nin marhay asin pig-inkubar sa temperatura kan kwarto sa diklom sa laog nin 1 h. Pagkatapos kan pag-inkubar, an absorbance kan pinaghalo na reaksyon sinusukol sa 765 nm gamit an UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan). An konsentrasyon kan total na soluble phenols sa mga sample extract nadeterminaran gamit an gallic acid calibration curve (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) asin ipinahayag bilang mga miligramo kan katumbas kan gallic acid kada gramo nin preskong timbang (mg GAE g-1 preskong timbang).
An total na soluble flavonoid na laog nadeterminaran susog sa paagi ni Djeridane et al. (2006) na may dikit na mga pagbabago. Sa halipot na panahon, an 0.3 ml kan nasa itaas na methanol extract pighalo sa 0.3 ml kan 5% na solusyon nin aluminum chloride (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), makusog na pighalo asin dangan pig-inkubar sa temperatura kan kwarto sa laog nin 5 min, na sinundan kan pagdagdag nin 0.3 ml kan 0.3 ml kan 0.3 ml kan solusyon nin aluminum chloride pottaceum. (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt), lubos na pinaghalo asin pig-inkubar sa temperatura kan kwarto sa laog nin 30 min sa diklom. Pagkatapos kan pag-inkubar, an absorbance kan pinaghalo na reaksyon sinusukol sa 430 nm gamit an UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan). An konsentrasyon kan total na soluble flavonoids sa mga sample extract nadeterminaran gamit an rutin calibration curve (TCI America, Portland, OR, USA) dangan ipinahayag bilang mga miligramo kan katumbas kan rutin kada gramo kan preskong timbang (mg RE g-1 preskong timbang).
An total na libreng amino acid na laog kan mga dahon nin pisog nadeterminaran gamit an sarong pigbago na ninhydrin reagent (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) base sa paagi na iprinoponer ni Yokoyama asin Hiramatsu (2003) asin pigbago ni Sun et al. (2006). Sa halipot na panahon, 0.1 g kan tisyu sa daga an kinua gamit an pH 5.4 na buffer, asin 200 μL kan supernatant an pig-react sa 200 μL kan ninhydrin (2%) asin 200 μL kan pyridine (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), pig-inkubar sa tubig na nagbubukal sa laog nin 30 min, dangan pig-cool sa 580 nm gamit an UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Sa ibong na lado, an proline nadeterminaran sa paagi kan paagi ni Bates (Bates et al., 1973). An proline pig-extract gamit an 3% sulfosalicylic acid (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) asin pagkatapos kan centrifugation, 0.5 ml kan supernatant pighalo sa 1 ml glacial acetic acid (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) asin ninhydrin reagent, na pig-inkubar sa 90°C, asin pig-incubate sa 55°C sinusukol sa 520 nm gamit an parehong spectrophotometer arog kan nasa itaas. An total na libreng amino acid asin proline sa mga extract kan dahon nadeterminaran gamit an glycine asin proline calibration curves (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), sunod-sunod, asin ipinahayag bilang mg/g na preskong timbang.
Tanganing madeterminaran an enzymatic na aktibidad kan mga antioxidant enzyme, mga 500 mg nin homogenized na tisyu an kinua gamit an 3 ml nin 50 mM Tris buffer (pH 7.8) na igwa nin 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) asin 7.5% polylypyrrolyvinone (PH 7.8; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), pig-centrifuge sa 10,000 × g sa laog nin 20 min sa irarom nin pagpalamig (4 °C), asin an supernatant (crude enzyme extract) tinipon (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). An Catalase (CAT) dangan pigreak sa 2 ml nin 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) asin 100 μl nin 269 mM H2O2 na solusyon tanganing madeterminaran an aktibidad kaini sa enzymatic susog sa paagi kan Aebi (1984) na may mga modipikasyon slight-Nagar et al. 2023; Osman et al., 2023). An aktibidad kan enzymatic Guaiacol-dependent peroxidase (POX) nadeterminaran gamit an paagi ni Harrach et al. (2009). (2008) na may saradit na modipikasyon (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) asin an enzymatic na aktibidad kan polyphenol oxidase (PPO) nadeterminaran pagkatapos kan reaksyon sa 2.2 ml kan 100 mM sodium phosphate buffer (pH 600 mM sodium phosphate buffer (pH 6.000), guacolials (000 μT), mga kemikal (CIC100, 000). Portland, OR, USA) asin 100 μl nin 12 mM H2O2. An paagi medyo binago gikan sa (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). An assay ginibo pagkatapos kan reaksyon sa 3 ml nin solusyon nin catechol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 M) na bagong pigpreparar sa 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0). An aktibidad kan CAT sinusukol sa paagi nin pag-monitor kan pagkabulok kan H2O2 sa 240 nm (A240), an aktibidad kan POX sinusukol sa paagi nin pag-monitor kan paglangkaw kan absorbance sa 436 nm (A436), asin an aktibidad kan PPO sinusukol sa paagi nin pagrekord kan mga pagbabago sa absorbance sa 495 nm (A495) kada 30 min sa laog nin 30 min gamit an UV-phorometer 1060 (Shimadzu, Hapon).
An real-time RT-PCR ginamit tanganing mahiling an mga lebel kan transcript kan tolong gene na may relasyon sa antioxidant, kabali an peroxisomal catalase (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superoxide dismutase (PvSOD; GenBank Accession No. XM_06863955), asin glutase reductone (GenBank Accession No. Accession No. KY195009.1), sa mga dahon nin pisog (an ikaduwa asin ikatolong lubos nang natalubo na dahon gikan sa itaas) 72 h pagkatapos kan huring pagbolong. Sa halipot na tataramon, an RNA pig-isolate gamit an Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) susog sa protocol kan paragibo. Dangan, an cDNA pig-synthesize gamit an TOP scriptTM cDNA Synthesis Kit susog sa mga instruksyon kan paragibo. An mga primer sequences kan tolong gene sa itaas nakalista sa Supplementary Table S3. An PvActin-3 (GenBank accession number: XM_068616709.1) ginamit bilang gene sa pag-ataman sa harong asin an relatibong ekspresyon kan gene kinarkulo gamit an 2-ΔΔCT na paagi (Livak asin Schmittgen, 2001). An estabilidad kan actin sa irarom kan biotic stress (dai magkakasundo na interaksiyon sa pag-ultanan kan mga komun na legume asin an anthracnose fungus na Colletotrichum lindemuthianum) asin abiotic stress (tigmara, salinidad, hababang temperatura) ipinaheling (Borges et al., 2012).
Enot kaming naggibo nin sarong genome-wide in silico analysis kan mga protina kan oxaloacetate acetylhydrolase (OAH) sa S. sclerotiorum gamit an protein-protein BLAST tool (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Sa halipot na tataramon, ginamit niamo an OAH gikan sa Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank accession number XP_040799428.1; 342 amino acids) asin Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 942181; GenBank accession number; XP_056833920.1; 316 amino acids) bilang mga pagkasunod-sunod nin kahaputan tanganing ma-mapa an homologous na protina sa S. sclerotiorum (taxide: 5180). An BLASTp ginibo laban sa pinakabagong makukuang datos kan genome kan S. sclerotiorum sa GenBank sa website kan National Center for Biotechnology Information (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Dugang pa, an pigprediktar na OAH gene gikan sa S. sclerotiorum (SsOAH) asin an ebolusyonaryong pag-analisar asin phylogenetic tree kan AfOAH gikan sa A. fijiensis CBS 313.89 asin PlOAH gikan sa P. lagena pig-infer gamit an maximum likelihood method sa MEGA11 (Tamura et al., 2021) asin JTT-based na modelo (JTT et al. al., 1992). An phylogenetic tree pinagsararo sa multiple alignment analysis kan mga protina na mga pagkasunod-sunod kan gabos na pigpreprediktar na OAH genes (SsOAH) gikan sa S. sclerotiorum asin an query sequence gamit an Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools//cobalt_cobalt. Agarwala, 2007). Dugang pa, an pinakamarahay na pagkakapareho kan mga amino acid sequences kan SsOAH gikan sa S. sclerotiorum nakalinya sa mga query sequences (AfOAH asin PlOAH) (Larkin et al., 2007) gamit an ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), asin an mga napreserbar na rehiyon pig-align sa laog kan ESP kasangkapan (bersyon 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Dugang pa, an mga pigpreprediktar na mga functional representative domain asin mga konserbadong lugar kan S. sclerotiorum SsOAH interaktibong pigklasipikar sa manlaen-laen na pamilya gamit an InterPro tool (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Sa katapustapusi, an tolong-dimensyonal (3D) na pagmodelo kan estruktura kan pigpreprediktar na S. sclerotiorum SsOAH ginibo gamit an Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.c.gid=index) (Kelley et al., et al. 2015) asin pig-validate gamit an SWISS-MODEL server (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). An mga pigprediktar na tolong-dimensyonal na estruktura (PDB format) interaktibong nahiling gamit an UCSF-Chimera package (bersyon 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
An quantitative real-time fluorescence PCR ginamit tanganing madeterminaran an lebel kan transkripsyon kan oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH; GenBank accession number: XM_001590428.1) sa mycelia kan Sclerotinia sclerotiorum. Sa halipot na panahon, an S. sclerotiorum pig-inokular sa sarong flask na igwa nin PDB asin ibinugtak sa sarong nag-uuyog na incubator (modelo: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) sa 25 ± 2 °C sa laog nin 24 h sa 150 rpm asin sa danay na kadikloman (24 h) tanganing pukawon an pagtalubo kan mycelial. Pagkatapos kaini, an mga selula tinawan nin L-ornithine asin kan fungicide na Rizolex-T sa huring konsentrasyon kan IC50 (mga 40 asin 3.2 mg/L, sunod-sunod) asin dangan pigkultibar sa laog nin 24 h sa irarom kan parehong kondisyon. Pagkatapos kan pag-inkubar, an mga kultura pig-centrifuge sa 2500 rpm sa laog nin 5 min asin an supernatant (fungal mycelium) tinipon para sa pag-analisar kan ekspresyon kan gene. Siring man, an fungal mycelium nakolekta sa 0, 24, 48, 72, 96, asin 120 h pagkatapos kan impeksyon gikan sa mga naulakitan na tinanom na nagbilog nin puting amag asin cottony mycelium sa ibabaw kan mga naulakitan na tisyu. An RNA kinua sa fungal mycelium dangan an cDNA pig-synthesize siring sa ipinaliwanag sa itaas. An mga primer sequences para sa SsOAH nakalista sa Supplementary Table S3. An SsActin (GenBank accession number: XM_001589919.1) ginamit bilang gene sa pag-ataman sa harong, asin an relatibong ekspresyon kan gene kinarkulo gamit an 2-ΔΔCT na paagi (Livak asin Schmittgen, 2001).
An oxalic acid nadeterminaran sa potato dextrose broth (PDB) asin mga sample nin tinanom na igwa kan fungal pathogen na Sclerotinia sclerotiorum susog sa paagi ni Xu asin Zhang (2000) na may dikit na mga modipikasyon. Sa halipot na panahon, an mga S. sclerotiorum isolates pig-inokular sa mga flask na igwa nin PDB dangan pigkultibar sa sarong shaking incubator (modelo I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) sa 150 rpm sa 25 ± 2 °C sa laog nin 3-5 aldaw sa danay na kadikloman (24 h) tanganing pukawon an pagtalubo kan mycelial. Pagkatapos kan pag-inkubar, an kultura nin fungi enot na sinala sa Whatman #1 filter paper dangan pig-centrifuge sa 2500 rpm sa laog nin 5 min tanganing mahale an natatadang mycelium. An supernatant tinipon asin itinago sa 4°C para sa dugang pang kuantitatibong pagdeterminar kan oxalate. Para sa pag-andam kan mga sampol nin tinanom, mga 0.1 g nin mga pidaso nin tisyu nin tinanom an kinua nin tolong beses gamit an distilled water (2 ml kada beses). An mga sample dangan pig-centrifuge sa 2500 rpm sa laog nin 5 min, an supernatant pig-dry filter sa Whatman No. 1 filter paper asin tinipon para sa dugang na pag-analisar.
Para sa kuantitatibong pag-analisar kan oxalic acid, an pinaghalo na reaksyon pigpreparar sa sarong tubo na may takop na salming sa minasunod na pagkasunod-sunod: 0.2 ml nin sample (o PDB culture filtrate o oxalic acid standard solution), 0.11 ml nin bromophenol blue (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, USA, PA, Ml 1919), Ml. sulfuric acid (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) asin 0.176 ml nin 100 mM potassium dichromate (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), dangan an solusyon pigtunaw sa 48 mM na tubig, pighalo nin makusog. tulos na ibinugtak sa 60 °C na kariguan nin tubig. Pakalihis nin 10 min, an reaksyon pinundo sa paagi nin pagdagdag nin 0.5 ml nin solusyon nin sodium hydroxide (NaOH; 0.75 M). An absorbance (A600) kan pinaghalo na reaksyon sinusukol sa 600 nm gamit an UV-160 spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan). An PDB asin distilled water ginamit bilang mga kontrol para sa pagkwantipika kan mga filtrate kan kultura asin mga sample nin tinanom, sunod-sunod. An mga konsentrasyon nin oxalic acid sa mga filtrate kan kultura, na ipinapahayag bilang mga mikrogramo nin oxalic acid kada mililitro kan PDB medium (μg.mL−1), asin sa mga ekstraktong dahon, na ipinapahayag bilang mga mikrogramo nin oxalic acid kada gramo nin preskong timbang (μg.g−1 FW), nadeterminaran gamit an oxalic acid curvetion (The Firmors Siyentipikong Kemikal, Waltham, MA, USA).
Sa bilog na pag-aadal, an gabos na eksperimento dinisenyo sa sarong kumpletong randomisadong disenyo (CRD) na may anom na biyolohikal na replika kada pagbolong asin limang kaldero kada biyolohikal na replika (duwang tinanom kada kaldero) apwera kun iba an sinasabi. An mga biolohikong replika pinag-analisar sa duplikado (duwang teknikal na replika). An mga teknikal na replika ginamit tanganing tsekan an reproducibility kan parehong eksperimento alagad dai ginamit sa estadistikal na pag-analisar tanganing maibitaran an mga putik na replika. An mga datos pinag-analisar sa estadistika gamit an pag-analisar kan pagkakaiba-iba (ANOVA) na sinundan kan Tukey-Kramer honestly significant difference (HSD) test (p ≤ 0.05). Para sa mga eksperimento sa vitro, an mga halaga kan IC50 asin IC99 kinarkulo gamit an modelo nin probit asin an 95% na mga agwat nin kumpiyansa kinarkulo.
May total na apat na mga isolate an nakolekta gikan sa manlaen-laen na oma nin toyo sa El Ghabiya Governorate, Egypt. Sa PDA medium, an gabos na isolates nagprodusir nin creamy white mycelium na marikas na nagin cottony white (Figure 1A) dangan beige o brown sa sclerotium stage. An mga sclerotia parati mahibog, itom, bilog o iregular an porma, 5.2 sagkod 7.7 mm an laba asin 3.4 sagkod 5.3 mm an diametro (Figure 1B). Dawa ngani apat na mga isolate an nagkaigwa nin marginal na pattern nin sclerotia sa gilid kan medium nin kultura pagkatapos nin 10-12 aldaw nin pag-inkubar sa 25 ± 2 °C (Fig. 1A), an bilang kan mga sclerotia kada plato magkakalaen na gayo sa sainda (P < 0.001), na an isolate 3 igwa kan pinakahalangkaw na bilang nin sclerotia (333 ± 33. sclerotia kada plato; Fig. 1C). Siring man, an isolate #3 nagprodusir nin mas dakul na oxalic acid sa PDB kisa sa ibang mga isolate (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Fig. 1D). An isolate #3 nagpahiling nin tipikal na morpolohikal asin mikroskopikong mga karakteristiko kan phytopathogenic fungus na Sclerotinia sclerotiorum. Halimbawa, sa PDA, an mga kolonya kan isolate #3 marikas na nagdakula, creamy white (Figure 1A), reverse beige o light salmon yellow-brown, asin nangangaipo nin 6-7 aldaw sa 25 ± 2°C tanganing lubos na matahoban an ibabaw kan sarong 9 cm na diametro na plato. Base sa mga morpolohikal asin mikroskopikong karakteristiko sa itaas, an isolate #3 nabisto bilang Sclerotinia sclerotiorum.
Pigura 1. Mga karakteristiko asin pathogenicity kan mga isolate kan S. sclerotiorum gikan sa mga komun na pananom na legume. (A) Pagtalubo kan mycelial kan apat na S. sclerotiorum isolates sa PDA medium, (B) sclerotia kan apat na S. sclerotiorum isolates, (C) bilang kan sclerotia (kada plato), (D) oxalic acid secretion sa PDB medium (μg.mL−1), asin (E) grabidad kan helang (%) kan apat na sclerotiorum isolates na madaling mabiktima sa commercial sclerotiorum sclerotia. cultivar Giza 3 sa irarom kan mga kondisyon nin greenhouse. An mga halaga nagrerepresentar kan mean ± SD kan limang biological replicates (n = 5). An manlaen-laen na letra nagpapahiling nin mga pagkakaiba na may kahulugan sa estadistika sa pag-ultanan kan mga pagbolong (p < 0.05). (F–H) An tipikal na mga sintomas nin puting amag naglataw sa mga lindog asin silique sa itaas kan daga, sunod-sunod, 10 aldaw pagkatapos kan pagbakuna sa isolate #3 (dpi). (I) An ebolusyonaryong pag-analisar kan internal transcribed spacer (ITS) na rehiyon kan S. sclerotiorum isolate #3 ginibo gamit an maximum likelihood method asin pigkumpara sa 20 na mga reference isolates/strains na nakua gikan sa National Center for Biotechnology Information (NCBI) database (https://www.ncbi.nlm.h.v./). An mga numero sa itaas kan mga linya nin paggrupo nagpapahiling kan sakop kan rehiyon (%), asin an mga numero sa ibaba kan mga linya nin paggrupo nagpapahiling kan laba kan sanga.
Dugang pa, tanganing kumpirmaron an pathogenicity, apat na nakuang S. sclerotiorum isolates an ginamit sa pag-inokulate kan madaling mabiktima na komersyal na cultivar nin pisog na Giza 3 sa irarom kan mga kondisyon nin greenhouse, na angay sa mga postulate ni Koch (Fig. 1E). Dawa ngani an gabos na nakuang fungal isolates mga pathogenic asin pwedeng makaulakit sa berdeng pisog (cv. Giza 3), na nagigin dahelan nin tipikal na mga sintomas nin puting amag sa gabos na parte sa itaas kan daga (Fig. 1F), orog na sa mga gamot (Fig. 1G) asin mga pods (Fig. 1H) sa 10 aldaw pagkatapos kan pag-inoculate), an isolate iyo an pinakaagresibong isolate (pig. 3 duwang independienteng eksperimento. An Isolate 3 igwa kan pinakahalangkaw na grabe kan helang (%) sa mga tinanom na pisog (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, asin 76.7 ± 3.1 sa 7, 14, asin 21 aldaw pagkatapos kan impeksyon, sunod-sunod; Pigura 1F).
An pagmidbid kan pinaka-invasive na S. sclerotiorum isolate #3 orog pang nakumpirma base sa internal transcribed spacer (ITS) sequencing (Fig. 1I). An pag-analisar kan phylogenetic sa pag-ultanan kan isolate #3 asin 20 na mga reference isolate/strain nagpahiling nin halangkaw na pagkakapareho (>99%) sa pag-ultanan ninda. Mahalagang mangnohon na an S. sclerotiorum isolate #3 (533 bp) igwa nin halangkaw na pagkakaagid sa Amerikanong S. sclerotiorum isolate LPM36 na naisuway gikan sa mga pisog nin tuyong gisantes (GenBank accession number MK896659.1; 540 bp) asin an Chinese S. sclerotiorum isolate YK896659.1; 540 bp) asin an Chinese S. sclerotiorum isolate YKYY accession number (GenBank OR206374.1; 548 bp), na nagigin dahelan kan pagkabulok kan lindog kan violet (Matthiola incana), na gabos pinaggrupo nin separado sa itaas kan dendrogram (Figure 1I). An bagong pagkasunod-sunod nadeposito sa database kan NCBI asin nginaranan na "Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25" (GenBank accession number PV202792). Mahihiling na an isolate 3 iyo an pinaka-invasive na isolate; kun kaya, an isolate na ini pinili para sa pag-aadal sa gabos na suminunod na eksperimento.
An antibacterial na aktibidad kan diamine L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) sa manlaen-laen na konsentrasyon (12.5, 25, 50, 75, 100 asin 125 mg/L) laban sa S. sclerotiorum isolate 3 pinag-adalan sa vitro. Mahalagang mangnohon na an L-ornithine nagkaigwa nin antibacterial na epekto asin luway-luway na nag-inhibit kan radial na pagtalubo kan S. sclerotiorum hyphae sa paaging nakadepende sa dosis (Figure 2A, B). Sa pinakahalangkaw na konsentrasyon na pigtestingan (125 mg/L), an L-ornithine nagpahiling kan pinakahalangkaw na mycelial growth inhibition rate (99.62 ± 0.27%; Figure 2B), na katumbas kan komersyal na fungicide na Rizolex-T (inhibition rate 99.45 ± 0.39%; Figure 22C) sa pinakahalangkaw na konsentrasyon na pigtesting (10 mg/L), Figure 2B C nagpapahiling nin kaparehong pagkaepektibo.
Pigura 2. In vitro antibacterial na aktibidad kan L-ornithine laban sa Sclerotinia sclerotiorum. (A) Pagkumpara kan aktibidad na antibakteryal kan manlaen-laen na konsentrasyon kan L-ornithine laban sa S. sclerotiorum sa komersyal na fungicide na Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Inhibition rate (%) kan S. sclerotiorum mycelial growth pagkatapos kan pagbolong na may manlaen-laen na konsentrasyon kan L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100 asin 125 mg/L) o Rizolex-T (2, 4, 6, 8 asin 10 mg/L), sunod-sunod. An mga halaga nagrerepresentar kan mean ± SD kan limang biological replicates (n = 5). An manlaen-laen na letra nagpapahiling nin mga pagkakaiba sa estadistika sa pag-ultanan kan mga pagbolong (p < 0.05). (D, E) Probit model regression analysis kan L-ornithine asin komersyal na fungicide na Rizolex-T, sunod-sunod. An probit model regression line ipinapahiling bilang sarong solidong asul na linya, asin an confidence interval (95%) ipinapahiling bilang sarong putol-putol na pulang linya.
Dugang pa, an probit regression analysis ginibo asin an mga katumbas na plot ipinapahiling sa Table 1 asin Figures 2D,E. Sa halipot na tataramon, an inaako na halaga nin bakilid (y = 2.92x − 4.67) asin an mga kaugnay na makahulogan na estadistika (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 asin p < 0.0001; Pigura 2D) kan L-ornithine nagpahiling nin sarong pinauswag na antifungal na aktibidad laban sa komersyal na sclerum sclerum. fungicide Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 asin p < 0.0001) (Table 1).
Table 1. Mga halaga kan half-maximum inhibitory concentration (IC50) asin IC99 (mg/l) kan L-ornithine asin komersyal na fungicide na “Rizolex-T” laban sa S. sclerotiorum.
Sa kabilogan, an L-ornithine (250 mg/L) makahulogan na nakabawas sa pag-uswag asin grabe kan puting amag sa mga tinatratong komun na tinanom na pisog kumpara sa mga dai tinatrato na mga tinanom na naulakitan nin S. sclerotiorum (kontrol; Pigura 3A). Sa halipot na tataramon, dawa ngani an grabe kan helang kan mga dai nabulong na naulakitan na mga tinanom na kontrol luway-luway na naglangkaw (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, asin 92.33 ± 3.06%), an L-ornithine makahulogan na nakabawas kan grabe kan helang (%) sa bilog na eksperimento (8.97 ± 1.05, asin 100 ± .00 26.36 ± 3.07) sa 7, 14, asin 21 aldaw pagkatapos kan pagbolong (dpt), sunod-sunod (Figure 3A). Siring man, kan an mga tinanom na pisog na naulakitan nin S. sclerotiorum tinawan nin 250 mg/L L-ornithine, an lugar sa irarom kan kurba nin pag-uswag kan helang (AUDPC) nagbaba poon 1274.33 ± 33.13 sa dai nabulong na kontrol pasiring sa 281.03 ± 7.95, na mas hababa nanggad kisa sa positibong 50 kontrol mg/L Rizolex-T fungicide (183.61 ± 7.71; Fig. 3B). An parehong uso naobserbaran sa ikaduwang eksperimento.
Fig. 3. Epekto kan exogenous na aplikasyon kan L-ornithine sa pag-uswag kan white rot kan komun na pisog na kawsa kan Sclerotinia sclerotiorum sa irarom kan mga kondisyon sa greenhouse. (A) Kurba nin pag-uswag kan helang kan puting amag kan komun na pisog pagkatapos kan pagbolong nin 250 mg/L L-ornithine. (B) Lugar sa irarom kan kurba nin pag-uswag kan helang (AUDPC) kan puting amag kan komun na pisog pagkatapos kan pagbolong sa L-ornithine. An mga halaga nagrerepresentar kan mean ± SD kan limang biological replicates (n = 5). An manlaen-laen na letra nagpapahiling nin mga pagkakaiba na may kahulugan sa estadistika sa pag-ultanan kan mga pagbolong (p < 0.05).
An exogenous na aplikasyon kan 250 mg/L L-ornithine luway-luway na naglangkaw kan langkaw kan tinanom (Fig. 4A), bilang kan mga sanga kada tinanom (Fig. 4B), asin bilang kan mga dahon kada tinanom (Fig. 4C) pagkatapos nin 42 aldaw. Mantang an komersyal na fungicide na Rizolex-T (50 mg/L) igwa nin pinakadakulang epekto sa gabos na mga parametro sa nutrisyon na pinag-adalan, an exogenous na aplikasyon kan 250 mg/L L-ornithine igwa nin ikaduwang pinakadakulang epekto kumpara sa mga kontrol na dai tinatratar (Figs. 4A–C). Sa ibong na lado, an pagbolong nin L-ornithine mayo nin mahalagang epekto sa laog kan mga pigment na photosynthetic na chlorophyll a (Fig. 4D) asin chlorophyll b (Fig. 4E), alagad medyo naglangkaw an total na laog kan carotenoid (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) kumpara sa negatibong kontrol (0.44 ± 0.03 mg/g fr wt) positibo asin wt g. kontrol (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; Fig. 4F). Sa kabilogan, an mga resultang ini nagpapahiling na an L-ornithine bakong phytotoxic sa mga tinatratong legumes asin pwedeng magpukaw kan saindang pagtalubo.
Fig. 4. Epekto kan exogenous L-ornithine application sa mga karakteristiko nin pagtalubo asin photosynthetic pigments kan mga dahon nin pisog na naulakitan nin Sclerotinia sclerotiorum sa irarom kan mga kondisyon nin greenhouse. (A) Lalangkaw kan tinanom (cm), (B) Bilang kan mga sanga kada tinanom, (C) Bilang kan mga dahon kada tinanom, (D) Laog nin chlorophyll a (mg g-1 fr wt), (E) Laog nin chlorophyll b (mg g-1 fr wt), (F) Total na laog nin carotenoid (mg g-1 fr wt). An mga halaga iyo an mean ± SD kan limang biological replicates (n = 5). An manlaen-laen na letra nagpapahiling nin mga pagkakaiba na may kahulugan sa estadistika sa pag-ultanan kan mga pagbolong (p < 0.05).
An in situ histochemical localisation kan mga reaktibong klase nin oksiheno (ROS; ipinapahayag bilang hydrogen peroxide [H2O2]) asin mga libreng radikal (pinapahayag bilang superoxide anions [O2•−]) nagbuyagyag na an exogenous na aplikasyon kan L-ornithine (250 mg/L) makahulogan na nakabawas kan pagtipon kan H2O (250 ± 2055 . nmol.g−1 FW; Fig. 5A) asin O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) kumpara sa pagtipon kan parehong dai nabulong na mga tinanom na naulakitan (173.31 ± 12.06 asin 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW) asin sunod-sunod na tinawan nin tinanom. mg/L kan komersyal na fungicide Rizolex-T (170.12 ± 9.50 asin 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt, sunod-sunod) sa 72 h. An halangkaw na lebel nin H2O2 asin O2•− natipon sa irarom kan hpt (Fig. 5A, B). Siring man, an TCA-based malondialdehyde (MDA) assay nagpahiling na an mga tinanom na pisog na naulakitan nin S. sclerotiorum nagtipon nin mas halangkaw na lebel nin MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) sa saindang mga dahon (Fig. 5C). Alagad, an exogenous na aplikasyon kan L-ornithine makahulogan na nabawasan an lipid peroxidation siring sa ipinapahiling kan pagbaba kan laog kan MDA sa mga tinanom na tinatrato (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Epekto kan exogenous L-ornithine application sa mga mayor na marker kan oxidative stress asin non-enzymatic antioxidant defense mechanisms sa mga dahon nin pisog na naulakitan nin S. sclerotiorum sa 72 h pagkatapos kan impeksyon sa irarom kan mga kondisyon nin greenhouse. (A) Hydrogen peroxide (H2O2; nmol g−1 FW) sa 72 hpt, (B) superoxide anion (O2•−; nmol g−1 FW) sa 72 hpt, (C) malondialdehyde (MDA; nmol g−1 FW) sa 72 hpt, (D) total na matunaw na phenols (GA) sa 7− g−1 FW hpt, (E) total na soluble flavonoids (mg RE g−1 FW) sa 72 hpt, (F) total na libreng amino acids (mg g−1 FW) sa 72 hpt, asin (G) proline content (mg g−1 FW) sa 72 hpt. An mga halaga nagrerepresentar kan mean ± standard deviation (mean ± SD) kan 5 biological replicates (n = 5). An manlaen-laen na letra nagpapahiling nin mga pagkakaiba na may kahulugan sa estadistika sa pag-ultanan kan mga pagbolong (p < 0.05).