Dati ming ibinareta na an lebel kan serum kan gut-derived tryptophan metabolite indole-3-propionic acid (IPA) mas hababa sa mga pasyente na may liver fibrosis. Sa pag-aadal na ini, inimbestigaran niamo an transcriptome asin DNA methylome sa mga mataba na atay na may relasyon sa lebel kan serum IPA, siring man an papel kan IPA sa pag-induce nin phenotypic inactivation kan mga hepatic stellate cells (HSCs) sa vitro.
An pag-aadal kabali an 116 na mga pasyenteng mataba na mayong type 2 diabetes mellitus (T2DM) (edad 46.8 ± 9.3 taon; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) na nag-agi nin bariatric surgery sa Kuopio Bariatric Surgery Center (KOBS). An mga lebel kan IPA na naglilibot sinusukol sa paagi nin liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), an pag-analisar kan transcriptome kan atay ginibo sa paagi nin total RNA sequencing, asin an pag-analisar kan DNA methylation ginibo gamit an Infinium HumanMethylation450 BeadChip. An mga selula nin hepatic stellate nin tawo (LX-2) ginamit para sa mga eksperimento sa vitro.
An lebel kan serum IPA may relasyon sa ekspresyon kan mga gene na imbuelto sa apoptotic, mitophagic, asin longevity pathways sa atay. An AKT serine/threonine kinase 1 (AKT1) gene iyo an pinakadakol asin dominanteng nakikipag-ulay na gene sa liver transcript asin DNA methylation profiles. An pagbolong kan IPA nag-induce nin apoptosis, nagbaba kan mitochondrial respiration, asin nagbago kan morpolohiya kan selula asin dinamika kan mitochondrial sa paagi nin pagmodulate kan ekspresyon kan mga gene na aram na nagreregular kan fibrosis, apoptosis, asin survival kan LX-2 cells.
Kun susumahon, an mga datos na ini nagsusuportar na an IPA igwa nin potensyal na mga epekto sa pagbolong asin pwedeng mag-induce nin apoptosis asin ibalyo an HSC phenotype pasiring sa sarong inaktibo na estado, sa siring nagpapahiwas kan posibilidad na mapugulan an liver fibrosis sa paagi nin pag-interfere sa HSC activation asin mitochondrial metabolism.
An pagkalakop kan obesity asin metabolic syndrome nakatakod sa nagdadakol na insidente nin metabolically associated fatty liver disease (MASLD); an helang nakakaapektar sa 25% sagkod 30% kan heneral na populasyon [1]. An mayor na resulta kan etiolohiya kan MASLD iyo an liver fibrosis, sarong dinamikong proseso na nabibisto sa paagi nin padagos na pagtipon nin fibrous extracellular matrix (ECM) [2]. An mga mayor na selula na imbuelto sa fibrosis kan atay iyo an mga hepatic stellate cells (HSCs), na nagpapahiling nin apat na midbid na phenotype: quiescent, activated, inactivated, asin senescent [3, 4]. An mga HSC pwedeng ma-aktibo asin ma-transdifferentiate gikan sa sarong quiescent na porma pasiring sa mga proliferative fibroblast-like cells na may halangkaw na pangangaipo sa enerhiya, na may mas halangkaw na ekspresyon kan α-smooth muscle actin (α-SMA) asin type I collagen (Col-I) [5, 6]. Sa panahon kan pagbaliktad kan fibrosis kan atay, an mga na-aktibar na HSC nahahale sa paagi nin apoptosis o inactivation. An mga prosesong ini kabali an pag-downregulate kan mga fibrogenic genes asin modulation kan mga prosurvival genes (arog kan NF-κB asin PI3K/Akt signaling pathways) [7, 8], siring man an mga pagbabago sa dinamika asin pagpunsyon kan mitochondrial [9].
An lebel kan serum kan tryptophan metabolite na indole-3-propionic acid (IPA), na nagigibo sa bituka, napag-araman na nagbaba sa mga helang sa metabolismo nin tawo kabali an MASLD [10–13]. An IPA konektado sa pag-inom nin hibla sa pagkakan, midbid sa mga epekto kaini na antioxidant asin anti-inflammatory, asin nagpapaluya kan diet-induced non-alcoholic steatohepatitis (NASH) phenotype sa vivo asin sa vitro [11-14]. An nagkapirang ebidensya hale sa samong nakaaging pag-aadal, na nagpahiling na an lebel kan serum IPA mas hababa sa mga pasyenteng may fibrosis sa atay kisa sa mga pasyenteng mataba na mayong fibrosis sa atay sa Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS). Dugang pa, ipinaheling niamo na an pagbolong nin IPA puedeng mabawasan an ekspresyon kan mga gene na klasikal na mga marker kan pagdikit kan selula, paglipat kan selula asin pag-aktibo kan hematopoietic stem cell sa sarong modelo nin human hepatic stellate cell (LX-2) asin sarong potensyal na hepatoprotective metabolite [15]. Alagad, dai pa malinaw kun pano an IPA nag-iinduce kan liver fibrosis regression sa paagi nin pag-aktibo kan HSC apoptosis asin mitochondrial bioenergetics.
Digdi, ipinapahiling niamo na an serum IPA konektado sa ekspresyon kan mga gene na mayaman sa apoptosis, mitophagy, asin mga agihan nin halawig na buhay sa atay kan mga indibidwal na mataba alagad bakong tipo 2 na diabetes (KOBS). Dugang pa, nanompongan niamo na an IPA puedeng mag-induce kan paghale asin pagkaraot kan mga activated hematopoietic stem cells (HSCs) sa paagi kan inactivation pathway. An mga resultang ini nagpapahiling nin sarong bagong papel para sa IPA, na ginigibo ining sarong potensyal na target sa pagbolong tanganing maipalakop an pag-atras kan fibrosis sa atay.
An sarong nakaaging pag-aadal sa KOBS cohort nagpahiling na an mga pasyente na may fibrosis sa atay igwa nin mas hababang lebel nin IPA na naglilibot kumpara sa mga pasyente na mayong fibrosis sa atay [15]. Tanganing dai maiiba an potensyal na nakakaribong na epekto kan type 2 diabetes, nagrekrut kami nin 116 na mga pasyenteng mataba na mayong type 2 diabetes (mean age ± SD: 46.8 ± 9.3 taon; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (Table 1) gikan sa padagos na pag-aadal kan KOBS bilang populasyon kan pag-aadal [16]. An gabos na partisipante nagtao nin nakasurat na may kaaraman na pagtugot asin an protocol kan pag-aadal inaprobaran kan Komite sa Etika kan North Savo County Hospital sosog sa Deklarasyon kan Helsinki (54/2005, 104/2008 asin 27/2010).
An mga espesimen kan biopsy kan atay nakua sa panahon kan operasyon sa bariatric asin pig-assess sa histolohiya kan mga eksperyensiyadong patologo susog sa mga dati nang ilinadawan na mga pamantayan [17, 18]. An mga pamantayan sa pagtasa pinagsumaryo sa Supplementary Table S1 asin ilinadawan na kaidto [19].
An mga sampol nin serum sa pag-ayuno pig-analisar sa paagi nin untargeted liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) para sa pag-analisar kan metabolomics (n = 116). An mga sample pig-analisar gamit an sarong sistemang UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germany) siring sa ipinaliwanag kaidto19. An pagmidbid kan isopropyl alcohol (IPA) nakabasar sa oras nin pagdanay asin pagkumpara kan MS/MS spectrum sa purong mga pamantayan. An IPA signal intensity (peak area) pigkonsiderar sa gabos na dugang pang pag-analisar [20].
An bilog na atay na RNA sequencing ginibo gamit an Illumina HiSeq 2500 asin an datos pig-preprocess siring sa ipinaliwanag kaidto [19, 21, 22]. Naggibo kami nin targeted differential expression analysis kan mga transcript na nakakaapektar sa mitochondrial function/biogenesis gamit an 1957 na gene na pinili gikan sa MitoMiner 4.0 database [23]. An pag-analisar kan methylation kan DNA kan atay ginibo gamit an Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) gamit an parehong metodolohiya na ipinaliwanag kaidto [24, 25].
An mga selula nin hepatic stellate nin tawo (LX-2) maboot na itinao ni Prof. Stefano Romeo asin pigkultibar asin pigmantenir sa DMEM/F12 medium (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 107-1026). Tanganing mapili an dosis nin pagtrabaho kan IPA, an mga selula nin LX-2 tinawan nin manlaen-laen na konsentrasyon nin IPA (10 μM, 100 μM asin 1 mM; Sigma, 220027) sa DMEM/F12 medium sa laog nin 24 h. Dugang pa, tanganing imbestigaran an kakayahan kan IPA na inaktibo an mga HSC, an mga selula nin LX-2 pig-co-treat sa 5 ng/ml TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) asin 1 mM IPA sa serum-free medium sa laog nin 24 h. Para sa mga katumbas na kontrol kan lunadan, 4 nM HCL na igwa nin 0.1% BSA an ginamit para sa pagbolong kan TGF-β1 asin 0.05% DMSO an ginamit para sa pagbolong kan IPA, asin parehong ginamit na magkaibanan para sa kombinasyon na pagbolong.
An apoptosis pig-assess gamit an FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit na may 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) susog sa mga instruksyon kan paragibo. Sa halipot na panahon, an LX-2 (1 × 105 na mga selula/bubon) pigkultibar sa bilog na banggi sa 12-bubon na mga plato dangan tinatrato nin dakol na dosis nin IPA o IPA asin TGF-β1. Kan suminunod na aldaw, an mga naglalataw asin nagdadanay na mga selula tinipon, pig-trypsinize, hinugasan nin PBS, pig-resuspend sa Annexin V binding buffer, asin pig-inkubar sa FITC-Annexin V asin 7-AAD sa laog nin 15 min.
An mga mitochondria sa mga buhay na selula tinina para sa aktibidad na oksidatibo gamit an MitotrackerTM Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Para sa mga MTR assay, an mga selula nin LX-2 pig-inkubar sa pantay na densidad sa IPA asin TGF-β1. Pakalihis nin 24 h, an mga buhay na selula pig-trypsinized, hinugasan nin PBS, dangan pig-inkubar sa 100 μM MTR sa serum-free medium sa 37 °C sa laog nin 20 min siring sa ipinaliwanag kaidto [ 26 ]. Para sa pag-analisar kan morpolohiya kan buhay na selula, an kadakulaan kan selula asin an komplikado kan sitoplasma pinag-analisar gamit an mga parametro kan forward scatter (FSC) asin side scatter (SSC), sunod-sunod.
An gabos na datos (30,000 na pangyayari) nakua gamit an NovoCyte Quanteon (Agilent) asin inaanalisar gamit an NovoExpress® 1.4.1 o FlowJo V.10 software.
An oxygen consumption rate (OCR) asin extracellular acidification rate (ECAR) sinusukol sa totoong oras gamit an Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) na igwa nin Seahorse XF Cell Mito Stress susog sa mga instruksyon kan paragibo. Sa halipot na panahon, 2 × 104 LX-2 cells/well an itinanom sa XF96 cell culture plates. Pagkatapos kan pag-inkubar sa bilog na banggi, an mga selula tinawan nin isopropanol (IPA) asin TGF-β1 (Supplementary Methods 1). An pag-analisar kan datos ginibo gamit an Seahorse XF Wave software, na kabali an Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator. Gikan digdi, sarong Bioenergetic Health Index (BHI) an kinarkulo [27].
An total na RNA pig-transcribe sa cDNA. Para sa mga partikular na paagi, hilingon an reperensya [15]. An lebel kan mRNA kan Human 60S ribosomal acidic protein P0 (RPLP0) asin cyclophilin A1 (PPIA) ginamit bilang mga kontrol kan gene na konstitutibo. An QuantStudio 6 pro Real-Time PCR System (Thermo Fisher, Landsmeer, The Netherlands) ginamit kaiba an TaqManTM Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) o an Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050), asin an relatibong gene expression kinarkulo gamit an cyc mga parametro (ΔΔCt) asin an ∆∆Ct na paagi. An mga detalye kan mga primer itinatao sa Supplementary Tables S2 asin S3.
An Nuclear DNA (ncDNA) asin mitochondrial DNA (mtDNA) kinua gamit an DNeasy blood and tissue kit (Qiagen) siring sa ipinaliwanag kaidto [28]. An relatibong kantidad kan mtDNA kinarkulo sa paagi nin pagkalkulo kan ratio kan lambang target na rehiyon nin mtDNA sa geometric mean kan tolong rehiyon kan nuclear DNA (mtDNA/ncDNA), siring sa detalyado sa Supplementary Methods 2. An mga detalye kan mga primer para sa mtDNA asin ncDNA itinatao sa Supplementary Table S4.
An mga buhay na selula tinina gamit an MitotrackerTM Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) tanganing mahiling an mga intercellular asin intracellular mitochondrial networks. An mga selula nin LX-2 (1 × 104 na selula/bubon) pigkultibar sa mga slide nin salming sa mga katumbas na plato nin kultura na may irarom na salming (Ibidi GmbH, Martinsried, Germany). Pakalihis nin 24 h, an mga buhay na selula nin LX-2 pig-inkubar sa 100 μM MTR sa laog nin 20 min sa 37 °C asin an mga nukleo kan selula tinina nin DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) siring sa ipinaliwanag kaidto [29]. An mga mitochondrial network pig-imahinar gamit an Zeiss Axio Observer inverted microscope (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) na igwa nin Zeiss LSM 800 confocal module sa 37 °C sa sarong humidified na atmospera na may 5% CO2 gamit an 63×NA 1.3 obhetibo. Nakakua kami nin sampulong Z-series na mga imahe para sa lambang klase nin sampol. An lambang Z-series igwa nin 30 na seksyon, na an lambang saro may kapal na 9.86 μm. Para sa lambang sample, an mga imahe kan sampulong manlaen-laen na larangan nin paghiling nakua gamit an ZEN 2009 software (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany), asin an pag-analisar kan morpolohiya kan mitochondria ginibo gamit an ImageJ software (v1.54d) [30, 31] susog sa mga parametro na detalyado sa Supplementary Methods 3.
An mga selula pig-ayos gamit an 2% glutaraldehyde sa 0.1 M phosphate buffer, na sinundan nin pag-ayos gamit an 1% osmium tetroxide solution (Sigma Aldrich, MO, USA), luway-luway na pig-dehydrate gamit an acetone (Merck, Darmstadt, Germany), asin sa katapustapusi pig-embed sa epoxy resin. An mga ultrathin na seksyon pigpreparar asin tinina nin 1% uranyl acetate (Merck, Darmstadt, Germany) asin 1% lead citrate (Merck, Darmstadt, Germany). An mga imahe na ultrastruktural nakua gamit an JEM 2100F EXII transmission electron microscope (JEOL Ltd, Tokyo, Japan) sa sarong nagpaparikas na boltahe na 80 kV.
An morpolohiya kan mga selula kan LX-2 na tinawan nin IPA sa laog nin 24 h pinag-analisar sa paagi nin phase-contrast microscopy sa 50x na pagpadakula gamit an Zeiss inverted light microscope (Zeiss Axio Vert.A1 asin AxioCam MRm, Jena, Germany).
An mga datos sa klinika ipinahayag bilang mean ± standard deviation o median (interquartile range: IQR). An one-way analysis of variance (mga padagos na variable) o χ2 test (mga kategorya na variable) ginamit tanganing ikumparar an mga pagkakaiba sa pag-ultanan kan tolong grupo nin pag-aadal. An false positive rate (FDR) ginamit sa pagkorehir para sa dakol na pag-eksamin, asin an mga gene na may FDR < 0.05 pigkonsiderar na estadistikal na makahulogan. An Spearman correlation analysis ginamit tanganing i-correlate an CpG DNA methylation sa IPA signal intensity, na may nominal p values ​​(p < 0.05) na ibinareta.
An pag-analisar kan agihan ginibo gamit an sarong web-based gene set analysis tool (WebGestalt) para sa 268 na mga transkrip (nominal p < 0.01), 119 na mga transkrip na may relasyon sa mitochondria (nominal p < 0.05), asin 4350 na CpGs gikan sa 3093 na mga transkrip sa atay na may relasyon sa mga lebel kan IPA na naglilibot sa serum. An libreng makukuang Venny DB (bersyon 2.1.0) na kasangkapan ginamit sa paghanap nin mga nag-oorog na gene, asin an StringDB (bersyon 11.5) ginamit sa pag-imahinar kan mga interaksiyon kan protina-protina.
Para sa eksperimento kan LX-2, an mga sample pigtestingan para sa normalidad gamit an D'Agostino-Pearson test. An mga datos nakua gikan sa dai mababa sa tolong biological replicates asin ipinasairarom sa one-way ANOVA na may Bonferroni post hoc test. An p-value na mas hababa sa 0.05 pigkonsiderar na estadistikal na makahulogan. An mga datos ipinapahiling bilang mean ± SD, asin an bilang kan mga eksperimento ipinapahiling sa lambang pigura. An gabos na pag-analisar asin graph ginibo gamit an GraphPad Prism 8 statistical software para sa Windows (GraphPad Software Inc., bersyon 8.4.3, San Diego, USA).
Enot, inimbestigaran niamo an asosasyon kan lebel kan serum IPA sa mga transkrip kan atay, bilog na hawak, asin mitochondrial. Sa total na profile kan transcript, an pinakamatibay na gene na may koneksyon sa lebel kan serum IPA iyo an MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 3); sa mitochondria-related transcript profile, an pinakamatibay na asosyadong gene iyo an AKT1 (FDR = 0.7621; AKT serine/threonine kinase 1) (Dugang na file 1 asin Dagdag na file 2).
Dangan inaanalisar niamo an mga pankinaban na transkrip (n = 268; p < 0.01) asin mga transkrip na may relasyon sa mitochondria (n = 119; p < 0.05), na sa kahurihurihi namidbid an apoptosis bilang an pinaka-signipikanteng kanonikal na agihan (p = 0.0089). Para sa mga transkrip kan mitochondria na may relasyon sa lebel kan serum IPA, nagtutok kami sa apoptosis (FDR = 0.00001), mitophagy (FDR = 0.00029), asin mga agihan nin pagsenyas kan TNF (FDR = 0.000006) (Figure 1A, Table 2, asin Supplementary Figures 1A-B).
Nag-oorog na pag-analisar kan pankinaban, mga transkrip na may relasyon sa mitochondria, asin DNA methylation sa atay nin tawo na may koneksyon sa lebel kan serum IPA. An A nagrerepresentar nin 268 na pankinaban na mga transkrip, 119 na mga transkrip na may relasyon sa mitochondria, asin mga transkrip na may DNA methylated na naka-mapa sa 3092 na mga CpG sites na may relasyon sa mga lebel kan serum IPA (p values ​​< 0.01 para sa global transcript asin DNA methylated, asin p values ​​< 0.00 para sa mitochondrial transcript). An mga mayor na nag-oorog na mga transkrip ipinapahiling sa tahaw (AKT1 asin YKT6). B An mapa nin interaksiyon kan 13 na gene na may pinakahalangkaw na marka nin interaksiyon (0.900) sa ibang mga gene ginibo gikan sa 56 na nag-oorog na mga gene (rehiyon nin itom na linya) na may mahalagang asosasyon sa mga lebel kan serum IPA gamit an online tool na StringDB. Berde: Mga gene na nakamapa sa Gene Ontology (GO) na sangkap na selula: mitochondria (GO:0005739). An AKT1 iyo an protina na may pinakahalangkaw na marka (0.900) para sa mga interaksiyon sa ibang mga protina base sa datos (base sa pagmimina nin teksto, mga eksperimento, mga database, asin co-expression). An mga network node nagrerepresentar nin mga protina, asin an mga gilid nagrerepresentar nin mga koneksyon sa pag-ultanan kan mga protina.
Nin huli ta an mga metabolite kan gut microbiota pwedeng magregulate kan epigenetic composition sa paagi kan DNA methylation [32], inimbestigaran niamo kun an mga lebel kan serum IPA may koneksyon sa liver DNA methylation. Nanompongan niamo na an duwang mayor na lugar nin methylation na may koneksyon sa lebel kan serum IPA harani sa proline-serine-rich region 3 (C19orf55) asin heat shock protein family B (sadit) na miyembro 6 (HSPB6) (Dugang na file 3). An DNA methylation kan 4350 CpG (p < 0.01) nakatakod sa mga lebel kan serum IPA asin napayaman sa mga agihan nin regulasyon sa longevity (p = 0.006) (Figure 1A, Table 2, asin Supplementary Figure 1C).
Tanganing masabutan an mga mekanismo biyolohikal na nakatago sa mga asosasyon sa pag-ultanan kan mga lebel kan serum IPA, mga global na transkrip, mga transkrip na may relasyon sa mitochondria, asin DNA methylation sa atay nin tawo, naggibo kami nin overlap analysis kan mga gene na namidbid sa nakaaging pathway analysis (Figure 1A). An mga resulta kan pag-analisar kan pagpayaman kan agihan kan 56 na nag-oorog na mga gene (sa laog kan itom na linya sa Figure 1A) nagpahiling na an apoptosis pathway (p = 0.00029) nag-highlight nin duwang gene na komun sa tolong pag-analisar: AKT1 asin YKT6 (YKT6 v-SNARE homolog), siring sa ipinapahiling sa Venuppleary diagram (S Figure 2 1A). Interesante, nanompongan niamo na an AKT1 (cg19831386) asin YKT6 (cg24161647) positibong may koneksyon sa lebel kan serum IPA (Dugang na file 3). Tanganing mamidbid an mga potensyal na interaksiyon nin protina sa pag-oltanan kan mga produkto nin gene, nagpili kami nin 13 na gene na may pinakahalangkaw na marka sa komun na rehiyon (0.900) sa 56 na nag-oorolay na mga gene bilang input asin naggibo nin mapa nin interaksiyon. Susog sa lebel nin kumpiyansa (marginal na kumpiyansa), an AKT1 gene na may pinakahalangkaw na marka (0.900) yaon sa itaas (Figure 1B).
Base sa pag-analisar kan agihan, nanompongan niamo na an apoptosis iyo an mayor na agihan, kaya inimbestigaran niamo kun baga an pagbolong kan IPA makakaapektar sa apoptosis kan HSCs sa vitro. Dati ming ipinaheling na an manlaen-laen na dosis nin IPA (10 μM, 100 μM, asin 1 mM) bakong nakakahilo sa mga selula nin LX-2 [15]. An pag-aadal na ini nagpahiling na an pagbolong nin IPA sa 10 μM asin 100 μM nagdagdag kan bilang kan mga viable asin necrotic cells. Alagad, kumpara sa grupong kontrol, an viability kan selula nagbaba sa 1 mM na konsentrasyon kan IPA, mantang an rate kan nekrosis kan selula nagdanay na dai nagbago (Figure 2A, B). Sunod, tanganing mahanap an pinakamarahay na konsentrasyon tanganing mag-induce nin apoptosis sa mga selula nin LX-2, pigtestingan niamo an 10 μM, 100 μM, asin 1 mM IPA sa laog nin 24 h (Figure 2A-E asin Supplementary Figure 3A-B). Interesante, an IPA 10 μM asin 100 μM nagpababa kan apoptosis rate (%), alagad, an IPA 1 mM nagpalangkaw kan late apoptosis asin apoptosis rate (%) kumpara sa kontrol asin kun kaya pinili para sa dugang pang mga eksperimento (Mga Pigura 2A–D).
An IPA nag-iinduce nin apoptosis kan mga selula nin LX-2. An Annexin V asin 7-AAD na dobleng pagmantsa na paagi ginamit tanganing ma-quantify an apoptotic rate asin morpolohiya kan selula sa paagi nin flow cytometry. An mga selula nin BA pig-inkubar sa 10 μM, 100 μM asin 1 mM IPA sa laog nin 24 h o sa F–H TGF-β1 (5 ng/ml) asin 1 mM IPA sa serum-free medium sa laog nin 24 h. A: mga buhay na selula (Annexin V -/ 7AAD-); B: mga selula na nekrotiko (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: amay (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: huri (Annexin V+/7AAD.+); E, H: porsyento kan total na amay asin huring apoptotic na mga selula sa apoptotic rate (%). An mga datos ipinapahayag bilang mean ± SD, n = 3 independienteng eksperimento. An mga pagkumpara sa estadistika ginibo gamit an one-way ANOVA na may Bonferroni post hoc test. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Siring sa ipinaheling ta na, an 5 ng/ml TGF-β1 puedeng mag-induce nin aktibasyon kan HSC sa paagi nin paglangkaw kan ekspresyon kan mga klasikal na gene na marker [15]. An mga selula nin LX-2 tinawan nin 5 ng/ml TGF-β1 asin 1 mM IPA na magkasararo (Fig. 2E–H). An pagbolong kan TGF-β1 dai nakabago kan apoptosis rate, alagad, an IPA co-treatment naglangkaw kan late apoptosis asin apoptosis rate (%) kumpara sa TGF-β1 na pagbolong (Fig. 2E–H). An mga resultang ini nagpapahiling na an 1 mM IPA puedeng magpalakop nin apoptosis sa mga selula nin LX-2 na independiente sa induksyon kan TGF-β1.
Orog pa niamong inimbestigaran an epekto kan IPA sa mitochondrial respiration sa mga selula nin LX-2. An mga resulta nagpahiling na an 1 mM IPA nagpababa kan mga parametro kan oxygen consumption rate (OCR): non-mitochondrial respiration, basal asin maximal respiration, proton leak asin ATP production kumpara sa grupong kontrol (Figure 3A, B), mantang an bioenergetic health index (BHI) dai nagbago.
An IPA minabawas kan paghangos kan mitochondria sa mga selula kan LX-2. An mitochondrial respiration curve (OCR) ipinapahiling bilang mga parametro kan mitochondrial respiration (non-mitochondrial respiration, basal respiration, maximal respiration, proton leak, ATP generation, SRC asin BHI). An mga selula A asin B pig-inkubar sa 10 μM, 100 μM asin 1 mM IPA sa laog nin 24 h, sunod-sunod. An mga selula C asin D pig-inkubar sa TGF-β1 (5 ng/ml) asin 1 mM IPA sa serum-free medium sa laog nin 24 h, sunod-sunod. An gabos na pagsukol pig-normalize sa laog kan DNA gamit an CyQuant kit. BHI: bioenergetic health index; SRC: kapasidad nin reserba sa paghangos; OCR: rate nin pagkonsumo nin oksiheno. An mga datos ipinapahiling bilang mean ± standard deviation (SD), n = 5 independienteng eksperimento. An mga pagkumpara sa estadistika ginibo gamit an one-way ANOVA asin Bonferroni post hoc test. *p < 0.05; **p < 0.01; asin ***p < 0.001
Tanganing magkaigwa nin mas komprehensibong pakasabot kan epekto kan IPA sa bioenergetic profile kan TGF-β1-activated LX-2 cells, inaanalisar niamo an mitochondrial oxidative phosphorylation sa paagi kan OCR (Fig. 3C,D). An mga resulta nagpahiling na an pagbolong kan TGF-β1 puedeng makabawas kan pinakahalangkaw na paghangos, kapasidad nin reserba sa paghangos (SRC) asin BHI kumpara sa grupong kontrol (Fig. 3C,D). Dugang pa, an kombinasyon na pagbolong nagpababa kan basal respiration, proton leak asin produksyon nin ATP, alagad an SRC asin BHI mas halangkaw nanggad kisa sa mga tinawan nin TGF-β1 (Fig. 3C,D).
Ginibo man niamo an “Cellular Energy Phenotype Test” na itinao kan Seahorse software (Supplementary Fig. 4A–D). Siring sa ipinapahiling sa Supplementary Fig. 3B, parehong an OCR asin ECAR metabolic potentials nagbaba pagkatapos kan TGF-β1 na pagbolong, alagad, mayo nin pagkakaiba an naobserbaran sa kombinasyon asin IPA na mga grupo nin pagbolong kumpara sa grupong kontrol. Dugang pa, parehong an basal asin stress na lebel kan OCR nagbaba pagkatapos kan kombinasyon asin pagbolong kan IPA kumpara sa grupong kontrol (Supplementary Fig. 4C). Interesante, an kaparehong pattern naobserbaran sa kombinasyon na terapiya, kun saen mayo nin pagbabago sa basal asin stress levels kan ECAR an naobserbaran kumpara sa TGF-β1 na pagbolong (Supplementary Fig. 4C). Sa HSCs, an pagbawas sa mitochondrial oxidative phosphorylation asin an kakayahan kan kombinasyon na pagbolong na ibalik an SCR asin BHI pagkatapos kan pagkakalantad sa TGF-β1 na pagbolong dai nakabago kan metabolikong potensyal (OCR asin ECAR). Kun susumahon, an mga resultang ini nagpapahiling na an IPA pwedeng mabawasan an bioenergetics sa HSCs, na nagsusuherir na an IPA pwedeng mag-induce nin mas hababang energetic profile na nagbabalyo kan HSC phenotype pasiring sa inactivation (Supplementary Figure 4D).
An epekto kan IPA sa dinamika kan mitochondrial pig-imbestigaran gamit an three-dimensional na pagkwantipika kan morpolohiya kan mitochondrial asin mga koneksyon sa network siring man an pagmantsa kan MTR (Figure 4 asin Supplementary Figure 5). Ipinapahiling kan Pigura 4 na, kumpara sa grupong kontrol, an pagbolong kan TGF-β1 nagpababa kan average na lugar kan ibabaw, bilang kan sanga, total na laba kan sanga, asin numero kan sanga (Figure 4A asin B) asin binago an proporsyon kan mitochondria gikan sa spherical pasiring sa intermediate morphology (Figure 4C). An pagbolong sana kan IPA an nagpababa kan average na volume kan mitochondria asin nagbago kan proporsyon kan mitochondria gikan sa spherical pasiring sa intermediate na morpolohiya kumpara sa grupong kontrol (Figure 4A). Sa kabaliktaran, an sphericity, mean branch length, asin mitochondrial activity na pig-assess kan mitochondrial membrane potential-dependent MTR (Figure 4A asin E) nagdanay na dai nagbago asin an mga parametro na ini dai nagkakaiba sa pag-ultanan kan mga grupo. Kun susumahon, an mga resultang ini nagsusuherir na an TGF-β1 asin IPA na pagbolong minalataw na nagmo-modulate kan porma asin kadakulaan kan mitochondrial siring man kan komplikado kan network sa mga nabubuhay na LX-2 cells.
An IPA nagbabago kan dinamika kan mitochondrial asin an abundansya kan mitochondrial DNA sa mga selula kan LX-2. A. Mga representanteng confocal na imahe kan mga buhay na LX-2 cells na pig-inkubar sa TGF-β1 (5 ng/ml) asin 1 mM IPA sa laog nin 24 h sa serum-free medium na nagpapahiling nin mga mitochondrial network na tinina nin MitotrackerTM Red CMXRos asin mga nuclei na tinina nin asul na may DAPI. An gabos na datos igwa nin dai mababa sa 15 na imahe kada grupo. Nakakua kami nin 10 Z-stack na mga imahe para sa lambang klase nin sample. An lambang Z-axis sequence igwa nin 30 na hiwa, na an lambang saro may kapal na 9.86 μm. Scale bar: 10 μm. B. Mga representanteng bagay (mitochondria sana) na namidbid sa paagi nin pag-aplikar nin adaptive thresholding sa imahe. An pag-analisar asin pagkumpara kan mga koneksyon kan mitochondrial morphological network ginibo para sa gabos na selula sa lambang grupo. C. Frekuensya kan mga ratio kan porma kan mitochondrial. An mga halaga na harani sa 0 nagpapahiling nin mga pormang bilog, asin an mga halaga na harani sa 1 nagpapahiling nin mga pormang garo filamento. D An laog kan Mitochondrial DNA (mtDNA) nadeterminaran siring sa ipinapaliwanag sa Mga Materyales asin Paagi. An pag-analisar kan E MitotrackerTM Red CMXRos ginibo sa paagi nin flow cytometry (30,000 na pangyayari) siring sa ipinapaliwanag sa Mga Materyales asin Paagi. An mga datos ipinapahiling bilang mean ± SD, n = 3 independienteng eksperimento. An mga pagkumpara sa estadistika ginibo gamit an one-way ANOVA asin Bonferroni post hoc test. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Dangan inanalisar niamo an laog kan mtDNA sa mga selula nin LX-2 bilang sarong indikasyon kan bilang kan mitochondrial. Kun ikukumpara sa grupong kontrol, an laog kan mtDNA naglangkaw sa grupong tinawan nin TGF-β1 (Figure 4D). Kun ikukumpara sa grupong tinawan nin TGF-β1, an laog kan mtDNA nagbaba sa grupong tinawan nin kombinasyon (Figure 4D), na nagsusuherir na an IPA pwedeng mabawasan an laog kan mtDNA asin posibleng an bilang kan mitochondrial siring man an mitochondrial respiration (Figure 3C). Dugang pa, an IPA garo baga nabawasan an laog kan mtDNA sa kombinasyon na pagbolong alagad dai nakaapektar sa MTR-mediated mitochondrial activity (Mga Pigura 4A–C).
Inimbestigaran niamo an asosasyon kan IPA sa mga lebel nin mRNA kan mga gene na may relasyon sa fibrosis, apoptosis, survival, asin dinamika kan mitochondrial sa mga selula nin LX-2 (Figure 5A–D). Kun ikukumpara sa grupong kontrol, an grupong tinawan nin TGF-β1 nagpahiling nin mas halangkaw na ekspresyon kan mga gene arog kan collagen type I α2 chain (COL1A2), α-smooth muscle actin (αSMA), matrix metalloproteinase 2 (MMP2), tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP1), asin nagpapahiling nin gene like RP1D naglangkaw na fibrosis asin aktibasyon. Dugang pa, kumpara sa grupong kontrol, an pagbolong kan TGF-β1 nagpababa kan lebel kan mRNA kan nuclear pregnane X receptor (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, inhibitor kan B-cell α, enhancer kan nuclear factor κ gene light peptide (NFκB1A), asin inhibitor kan nuclear factor κB kinase subunit β (FigBKB) 5A–D). Kun ikukumpara sa TGF-β1 na pagbolong, an kombinasyon na pagbolong na may TGF-β1 asin IPA nagpababa kan ekspresyon kan COL1A2 asin MMP2, alagad naglangkaw an lebel kan mRNA kan PXR, TIMP1, B-cell lymphoma-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, asin IKBB. An pagbolong kan IPA nakabawas na gayo kan ekspresyon kan MMP2, Bcl-2-associated protein X (BAX), AKT1, optic atrophy protein 1 (OPA1), asin mitochondrial fusion protein 2 (MFN2), mantang an ekspresyon kan CASP8, NFκB1A, NFκB1B, asin IKB naglangkaw kumpara sa kontrol na grupo. Alagad, mayo nin nakuang pagkakaiba sa ekspresyon kan caspase-3 (CASP3), apoptotic peptidase activating factor 1 (APAF1), mitochondrial fusion protein 1 (MFN1), asin fission protein 1 (FIS1). Sa kabilogan, an mga resultang ini nagsusuherir na an pagbolong kan IPA nagmo-modulate kan ekspresyon kan mga gene na may relasyon sa fibrosis, apoptosis, survival, asin mitochondrial dynamics. An samong datos nagsusuherir na an pagbolong kan IPA nakakabawas kan fibrosis sa mga selula kan LX-2; sa parehong panahon, ini nagpapakusog kan kaligtasan sa paagi nin pagbalyo kan phenotype pasiring sa inactivation.
An IPA nagmo-modulate kan ekspresyon kan fibroblast, apoptotic, viability, asin mitochondrial dynamics genes sa LX-2 cells. An mga histogram nagpapahiling nin ekspresyon kan mRNA relatibo sa endogenous control (RPLP0 o PPIA) pagkatapos na an mga selula nin LX-2 pig-induce gamit an TGF-β1 asin IPA sa serum-free medium sa laog nin 24 h. An A nagpapahiling nin mga fibroblast, an B nagpapahiling nin mga selula na apoptotiko, an C nagpapahiling nin mga nabubuhay na selula, asin an D nagpapahiling nin ekspresyon kan gene kan dinamika kan mitochondria. An mga datos ipinapahiling bilang mean ± standard deviation (SD), n = 3 independienteng eksperimento. An mga pagkumpara sa estadistika ginibo gamit an one-way ANOVA asin Bonferroni post hoc test. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Dangan, an mga pagbabago sa kadakulaan kan selula (FSC-H) asin komplikado kan sitoplasma (SSC-H) pig-assess sa paagi nin flow cytometry (Figure 6A,B), asin an mga pagbabago sa morpolohiya kan selula pagkatapos kan pagbolong kan IPA pig-assess sa paagi nin transmission electron microscopy (TEM) asin phase contrast microscopy (Supplementary Figure 6A-B). Siring sa linalaoman, an mga selula sa grupong tinatrato nin TGF-β1 naglangkaw sa kadakulaan kumpara sa grupong kontrol (Figure 6A,B), na nagpapahiling kan klasikong pagpahiwas kan magaspang na endoplasmic reticulum (ER*) asin phagolysosomes (P), na nagpapahiling nin aktibasyon kan hematopoietic stem cell (HSC) (Supplementary Figure 6A). Alagad, kumpara sa grupong tinawan nin TGF-β1, an kadakulaan kan selula, komplikado kan cytoplasmic (Fig. 6A,B), asin an laog kan ER* nagbaba sa grupong tinawan nin kombinasyon kan TGF-β1 asin IPA (Supplementary Fig. 6A). Dugang pa, an pagbolong nin IPA nagpababa kan kadakulaan kan selula, komplikado kan sitoplasma (Mga Fig. 6A,B), laog kan P asin ER* (Supplementary Fig. 6A) kumpara sa grupong kontrol. Dugang pa, an laog kan mga selula na apoptotic naglangkaw pagkatapos kan 24 h nin pagbolong kan IPA kumpara sa grupong kontrol (mga puting pana, Supplementary Fig. 6B). Sa kabilogan, an mga resultang ini nagsusuherir na an 1 mM IPA puedeng magpukaw kan apoptosis kan HSC asin baliktadon an mga pagbabago sa mga parametro kan morpolohiya kan selula na pinukaw kan TGF-β1, sa siring nagreregular kan kadakulaan asin komplikado kan selula, na puedeng may koneksyon sa pag-inaktibo kan HSC.
An IPA nagbabago kan kadakulaan kan selula asin komplikado kan sitoplasma sa mga selula kan LX-2. Mga representanteng imahe kan pag-analisar kan flow cytometry. An pag-analisar naggamit nin sarong estratehiya sa pag-gate na espesipiko para sa mga selula nin LX-2: SSC-A/FSC-A tanganing tawan nin kahulugan an populasyon nin selula, FSC-H/FSC-A tanganing mamidbid an mga doble, asin SSC-H/FSC-H para sa pag-analisar kan kadakulaan asin komplikado kan selula. An mga selula pig-inkubar sa TGF-β1 (5 ng/ml) asin 1 mM IPA sa serum-free medium sa laog nin 24 h. An mga selula kan LX-2 pigdistribwir sa ibabang wala na kwadrante (SSC-H-/FSC-H-), itaas na wala na kwadrante (SSC-H+/FSC-H-), ibabang too na kwadrante (SSC-H-/FSC-H+), asin itaas na too na kwadrante (SSC-H+/FSC-H+) para sa kadakulaan kan selula asin pag-analisar kan komplikado kan sitoplasma. B. An morpolohiya kan selula pig-analisar sa paagi nin flow cytometry gamit an FSC-H (forward scatter, cell size) asin SSC-H (side scatter, cytoplasmic complexity) (30,000 na pangyayari). An mga datos ipinapahiling bilang mean ± SD, n = 3 independienteng eksperimento. An mga pagkumpara sa estadistika ginibo gamit an one-way ANOVA asin Bonferroni post hoc test. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 asin ****p < 0.0001
An mga metabolite sa bituka arog kan IPA nagin mainit na tema nin pagsiyasat, na nagsusuherir na an mga bagong target pwedeng madiskobre sa mikrobyo sa bituka. Kaya interesante na an IPA, sarong metabolite na ikinonektar ta sa liver fibrosis sa mga tawo [15], ipinaheling na sarong potensyal na anti-fibrotic compound sa mga modelo nin hayop [13, 14]. Digdi, ipinapahiling niamo sa kaenot-enote an sarong asosasyon sa pag-ultanan kan serum IPA asin global na transcriptomics kan atay asin DNA methylation sa mga indibidwal na mataba na mayong type 2 diabetes (T2D), na nagtatampok kan apoptosis, mitophagy asin halawig na buhay, siring man an sarong posibleng kandidatong gene na AKT1 na nagreregular kan homeostasis kan atay. An saro pang kabagsikan kan samong pag-aadal iyo na ipinaheling niamo an interaksiyon kan pagbolong kan IPA sa apoptosis, morpolohiya kan selula, mitochondrial bioenergetics asin dinamika sa mga selula kan LX-2, na nagpapahiling nin mas hababang spektrum nin enerhiya na nagbabalyo kan HSC phenotype pasiring sa inactivation, na ginigibo an IPA na sarong potensyal na kandidato para sa pagpapauswag kan liver fibrosis.
Nanompongan niamo na an apoptosis, mitophagy asin halawig na buhay iyo an pinaka-importanteng mga kanonikal na agihan na pinayaman sa mga gene kan atay na may koneksyon sa naglilibot na serum IPA. An pagkadisturbo kan sistema nin pagkontrol kan kalidad kan mitochondria (MQC) pwedeng magresulta sa dysfunction kan mitochondrial, mitophagy asin apoptosis, na sa siring nagpapauswag kan pangyayari kan MASLD[33, 34]. Kaya, puede kitang mag-isip na an IPA pwedeng imbuelto sa pagmantenir kan dinamika kan selula asin integridad kan mitochondria sa paagi nin apoptosis, mitophagy asin halawig na buhay sa atay. An samong datos nagpahiling na duwang gene an komun sa tolong assay: YKT6 asin AKT1. Mahalagang mangnohon na an YKT6 sarong protina na SNARE na imbuelto sa proseso kan pagsasaro kan lamad kan selula. Ini igwa nin papel sa autophagy asin mitophagy sa paagi nin pagbilog nin sarong initiation complex sa STX17 asin SNAP29 sa autophagosome, sa siring nagpapauswag kan pagsasaro kan mga autophagosome asin lysosome[35]. Dugang pa, an pagkawara kan pagpunsyon kan YKT6 nagbubunga nin may diperensya sa mitophagy[36], mantang an pag-upregulate kan YKT6 konektado sa pag-uswag kan hepatocellular carcinoma (HCC), na nagpapahiling nin mas halangkaw na survival kan selula[37]. Sa ibong na lado, an AKT1 iyo an pinaka-importanteng nakikipag-ulay na gene asin igwa nin importanteng papel sa mga helang sa atay, kabali an PI3K/AKT signaling pathway, siklo kan selula, paglipat kan selula, pagdakol, focal adhesion, mitochondrial function, asin collagen secretion[38–40]. An aktibong PI3K/AKT signaling pathway pwedeng mag-aktibo kan hematopoietic stem cells (HSCs), na iyo an mga selula na responsable sa produksyon kan extracellular matrix (ECM), asin an dysregulation kaini pwedeng makakontribwir sa pangyayari asin pag-uswag kan liver fibrosis[40]. Dugang pa, an AKT saro sa mga pangenot na bagay sa pagbuhay kan selula na nag-uulang sa p53-dependent cell apoptosis, asin an aktibasyon kan AKT pwedeng may koneksyon sa pag-ulang kan apoptosis kan selula kan atay[41, 42]. An mga nakuang resulta nagsusuherir na an IPA pwedeng imbuelto sa apoptosis na may relasyon sa mitochondria kan atay sa paagi nin pag-apektar sa desisyon kan mga hepatocyte sa pag-oltanan kan paglaog sa apoptosis o survival. An mga epektong ini pwedeng i-regulate kan AKT asin/o YKT6 na mga kandidatong gene, na kritikal para sa homeostasis kan atay.
An samong mga resulta nagpahiling na an 1 mM IPA nag-induce nin apoptosis asin nagbaba kan mitochondrial respiration sa LX-2 cells na independiente sa TGF-β1 na pagbolong. Mahalagang mangnohon na an apoptosis sarong mayor na agihan para sa resolusyon kan fibrosis asin aktibasyon kan hematopoietic stem cell (HSC), asin saro man na pangenot na pangyayari sa reversible physiological response kan liver fibrosis [4, 43]. Dugang pa, an pagbalik kan BHI sa mga selula kan LX-2 pagkatapos kan kombinasyon na pagbolong nagtao nin mga bagong pananaw sa potensyal na papel kan IPA sa regulasyon kan mitochondrial bioenergetics. Sa irarom nin pagpahingalo asin bakong aktibong mga kondisyon, an mga selula nin hematopoietic normal na naggagamit nin mitochondrial oxidative phosphorylation tanganing makaprodusir nin ATP asin igwa nin hababang aktibidad sa metabolismo. Sa ibong na lado, an aktibasyon kan HSC nagpapauswag kan paghangos kan mitochondrial asin biosynthesis tanganing mabayadan an mga pangangaipo sa enerhiya sa paglaog sa estadong glycolytic [44]. An bagay na an IPA dai nakaapektar sa metabolikong potensyal asin ECAR nagsusuherir na an glycolytic pathway bakong gayong prayoridad. Siring man, an saro pang pag-aadal nagpahiling na an 1 mM IPA nakapagmodulate kan aktibidad kan mitochondrial respiratory chain sa mga cardiomyocyte, human hepatocyte cell line (Huh7) asin human umbilical vein endothelial cells (HUVEC); Alagad, mayo nin epekto an IPA na nakua sa glycolysis sa mga cardiomyocyte, na nagsusuherir na an IPA pwedeng makaapektar sa bioenergetics kan ibang klase nin selula [45]. Kaya, pig-espekulasyon niamo na an 1 mM IPA pwedeng magserbing sarong maluyang kemikal na uncoupler, nin huli ta ini makakabawas nin dakula sa fibrogenic gene expression, morpolohiya kan selula asin mitochondrial bioenergetics na dai binabago an kantidad kan mtDNA [46]. An mga uncoupler kan mitochondria puedeng makapugol sa fibrosis na pinukaw kan kultura asin aktibasyon kan HSC [47] asin mabawasan an produksyon nin mitochondrial ATP na pigreregular o pinupukaw kan nagkapirang protina arog kan mga protina sa pag-uncoupling (UCP) o adenine nucleotide translocase (ANT). Depende sa klase nin selula, an pangyayaring ini puedeng magprotehir sa mga selula gikan sa apoptosis asin/o magpalakop nin apoptosis [46]. Alagad, kaipuhan an dugang pang mga pag-aadal tanganing maipaliwanag an papel kan IPA bilang sarong mitochondrial uncoupler sa hematopoietic stem cell inactivation.
Dangan inimbestigaran niamo kun baga an mga pagbabago sa paghangos kan mitochondria nahihiling sa morpolohiya kan mitochondria sa mga buhay na selula nin LX-2. Interesante, an pagbolong kan TGF-β1 nagbabago kan proporsyon kan mitochondrial gikan sa spherical pasiring sa intermediate, na may pagbaba kan mitochondrial branching asin paglangkaw kan ekspresyon kan DRP1, sarong pangenot na bagay sa mitochondrial fission [48]. Dugang pa, an pagkabaranga kan mitochondria konektado sa kabilogan na komplikado kan network, asin an pagbalyo gikan sa pag-iriba pasiring sa pagbanga kritikal para sa aktibasyon kan hematopoietic stem cell (HSC), mantang an pagpugol kan pagbanga kan mitochondria minagiya sa apoptosis kan HSC [49]. Kaya, an samong mga resulta nagpapahiling na an pagbolong kan TGF-β1 pwedeng mag-induce nin pagbaba sa komplikado kan mitochondrial network na may pagbaba kan branching, na mas lakop sa mitochondrial fission na may koneksyon sa mga activated hematopoietic stem cells (HSCs). Dugang pa, an samong datos nagpahiling na an IPA pwedeng magbago kan proporsyon kan mitochondria gikan sa spherical pasiring sa intermediate na porma, sa siring nababawasan an ekspresyon kan OPA1 asin MFN2. An mga pag-aadal nagpahiling na an pag-downregulate kan OPA1 pwedeng magcausa nin pagbaba sa potensyal kan mitochondrial membrane asin magpukaw nin apoptosis kan selula[50]. An MFN2 midbid na nagmemediate kan mitochondrial fusion asin apoptosis[51]. An mga nakuang resulta nagsusuherir na an induksyon kan mga selula nin LX-2 sa paagi kan TGF-β1 asin/o IPA minalataw na nagmomodula kan porma asin kadakulaan kan mitochondrial, siring man an estado nin aktibasyon asin komplikado kan network.
An samong mga resulta nagpapahiling na an kombinasyon na pagbolong kan TGFβ-1 asin IPA puedeng mabawasan an mtDNA asin mga parametro sa morpolohiya kan selula sa paagi nin pagregulate kan ekspresyon kan mRNA kan fibrosis, apoptosis asin mga gene na may relasyon sa survival sa mga selula na naglilikay sa apoptosis. Tunay nanggad, an IPA nagpababa kan lebel nin ekspresyon kan mRNA kan AKT1 asin importanteng mga gene nin fibrosis arog kan COL1A2 asin MMP2, alagad naglangkaw an lebel nin ekspresyon kan CASP8, na may koneksyon sa apoptosis. An samong mga resulta nagpahiling na pagkatapos kan pagbolong kan IPA, an ekspresyon kan BAX nagbaba asin an ekspresyon kan mRNA kan mga subunit kan pamilya kan TIMP1, BCL-2 asin NF-κB naglangkaw, na nagsusuherir na an IPA puedeng magpukaw nin mga signal nin kaligtasan sa mga hematopoietic stem cells (HSCs) na naglilikay sa apoptosis. An mga molekulang ini pwedeng mag-akto bilang mga pro-survival signal sa mga aktibong hematopoietic stem cells, na pwedeng may koneksyon sa mas halangkaw na ekspresyon kan mga protina na anti-apoptotic (arog kan Bcl-2), nabawasan na ekspresyon kan pro-apoptotic BAX, asin sarong komplikadong interplay sa pag-ultanan kan TIMP asin NF-κB [5, 7]. An IPA nagpapahiling kan mga epekto kaini sa paagi kan PXR, asin nanompongan niamo na an kombinasyon na pagbolong sa TGF-β1 asin IPA nagpalangkaw kan lebel nin ekspresyon kan PXR mRNA, na nagpapahiling nin pagsugpo kan aktibasyon kan HSC. An aktibadong pagsenyas kan PXR aram na nakakapugol sa aktibasyon kan HSC pareho sa vivo asin sa vitro [52, 53]. An samong mga resulta nagpapahiling na an IPA pwedeng magpartisipar sa paghale kan mga aktibong HSC sa paagi nin pagpapauswag kan apoptosis, pagbawas kan fibrosis asin metabolismo kan mitochondrial, asin pagpapauswag kan mga signal nin survival, na mga tipikal na proseso na nagkokombertir kan aktibong HSC phenotype pasiring sa sarong inactivated. An saro pang posibleng paliwanag para sa potensyal na mekanismo asin papel kan IPA sa apoptosis iyo na ini nagkukua nin mga dysfunctional mitochondria sa paagi nin mitophagy (intrinsic pathway) asin an extrinsic TNF signaling pathway (Table 1), na direktang konektado sa NF-κB survival signaling pathway (Supplementary Figure 7). Interesante, an mga gene na may relasyon sa IPA nakakapag-induce nin mga signal na pro-apoptotic asin pro-survival sa apoptotic pathway [54], na nagsusuherir na an IPA pwedeng mag-induce kan apoptotic pathway o survival sa paagi nin pakikipag-ulay sa mga gene na ini. Alagad, kun pano an IPA nag-iinduce nin apoptosis o survival sa panahon kan HSC activation asin an mga mekanistikong agihan kaini nagdadanay na bakong malinaw.
An IPA sarong mikrobyo na metabolite na napoporma gikan sa dietary tryptophan sa paagi kan gut microbiota. An mga pag-aadal nagpahiling na igwa ining anti-inflammatory, antioxidant, asin epigenetic regulatory properties sa kapalibutan kan bituka.[55] An mga pag-aadal nagpahiling na an IPA pwedeng mag-modulate kan intestinal barrier function asin mabawasan an oxidative stress, na pwedeng makakontribwir sa mga lokal na epekto kaini sa pisyolohiya.[56] Sa katunayan, an IPA pigdadara sa mga target na organo sa paagi kan sirkulasyon, asin nin huli ta an IPA igwa nin kaparehong mayor na estruktura nin metabolite sa tryptophan, serotonin, asin mga derivatives kan indole, an IPA naggigibo nin mga aksyon metaboliko na nagreresulta sa mga kompetisyon na metabolikong kapaladan.[52] An IPA pwedeng makipagkumpetensya sa mga metabolite na hale sa tryptophan para sa mga lugar nin pagbugkos sa mga enzyme o receptor, na posibleng makadisturbo sa normal na mga agihan nin metabolismo. Ini nagpapahiling kan pangangaipo para sa dugang pang mga pag-aadal sa saiyang pharmacokinetics asin pharmacodynamics tanganing mas masabutan an saiyang therapeutic window.[57] Dai pa aram kun ini pwede man mangyari sa mga hematopoietic stem cells (HSCs).
Inaako niamo na an samong pag-adal igwa nin nagkapirang limitasyon. Tanganing partikularmenteng siyasaton an mga asosasyon na may relasyon sa IPA, dai niamo kaiba an mga pasyente na may type 2 diabetes mellitus (T2DM). Inaako niamo na ini naglilimit sa mahiwas na aplikabilidad kan samong mga nakua sa mga pasyente na may type 2 diabetes mellitus asin advanced liver disease. Dawa ngani an pisyolohikal na konsentrasyon kan IPA sa serum nin tawo 1–10 μM [11, 20], an konsentrasyon na 1 mM IPA pinili base sa pinakahalangkaw na bakong nakakahilo na konsentrasyon [15] asin an pinakahalangkaw na rate nin apoptosis, na mayong pagkakaiba sa porsyento kan populasyon kan nekrotikong selula. Dawa ngani an mga lebel nin supraphysiological kan IPA ginamit sa pag-aadal na ini, mayo pang pagkakaoroyon manungod sa epektibong dosis kan IPA [52]. Dawa ngani an samong mga resulta mahalaga, an mas mahiwas na metabolikong kapaladan kan IPA nagdadanay na sarong aktibong lugar nin pagsiyasat. Dugang pa, an samong mga nadiskubre sa asosasyon sa pag-ultanan kan lebel kan serum IPA asin DNA methylation kan mga transkrip kan atay nakua bako sanang gikan sa mga hematopoietic stem cells (HSCs) kundi pati na gikan sa mga tisyu kan atay. Pinili ming gamiton an mga selula nin LX-2 nin tawo base sa samong mga nakaaging nakua gikan sa pag-analisar kan transcriptome na an IPA may koneksyon sa aktibasyon kan hematopoietic stem cell (HSC) [15], asin an HSCs iyo an mga mayor na selula na imbuelto sa pag-uswag kan fibrosis kan atay. An atay kompuesto nin manlaen-laen na klase nin selula, kaya an ibang mga modelo nin selula arog kan hepatocyte-HSC-immune cell co-culture system na pinagsararo sa aktibasyon kan caspase asin DNA fragmentation siring man an mekanismo nin aksyon kabali an lebel nin protina dapat na konsideraron tanganing pag-adalan an papel kan IPA asin an interaksiyon kaini sa ibang klase nin selula kan atay.