An pag-sort kan protina sa secretory pathway mahalagang marhay para sa pagmantenir kan cell compartmentalization asin homeostasis. Dugang pa sa shell-mediated sorting, an papel kan mga lipid sa kinesin sorting sa proseso nin secretory transport sarong haloy nang pundamental na hapot na dai pa nasisimbag. Digdi, naggigibo kami nin 3D simultaneous multicolor high-resolution real-time imaging tanganing patunayan sa vivo na an mga bagong sintetikong glycosylphosphatidylinositol-immobilized na mga protina na may halawig na marhay na mga ceramide lipid moieties pinaggrupo asin pigklasipikar sa mga espesyalisadong endoplasma Net exit site, na iba sa mga transmembrane na protina na ginagamit. Dugang pa, ipinapahiling niamo na an laba kan kadena kan ceramide sa endoplasmic reticulum membrane kritikal para sa pagpili na ini nin pag-sort. An samong pag-aadal nagtatao kan pinakaenot na direktang in vivo na ebidensya tanganing maklasipikar an mga kargamento nin protina base sa laba kan kadena nin lipid sa mga piniling lugar nin pagluwas sa agihan nin pagluwas.
Sa mga selula nin eukaryotic, an mga protina na pig-synthesize sa endoplasmic reticulum (ER) dangan pig-aayos sa laog kan transportasyon sa paagi kan secretory pathway para sa paghatod sa saindang maninigong destinasyon kan selula (1). Dugang pa sa coat-mediated sorting, haloy nang pig-espekulasyon na an nagkapirang lipid pwede man magserbing selective exit points sa paagi nin pag-cluster sainda sa mga partikular na domain kan lamad na mga partikular na protina (2-5). Alagad, kulang pa man giraray an direktang in vivo na ebidensya tanganing patunayan an posibleng mekanismong ini na nakabase sa lipid. Tanganing masolusyunan an pundamental na problemang ini, pinag-adalan niamo sa lebadura kun pano an glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchored proteins (GPI-APs) magkakalaen na pig-eeksportar gikan sa ER. An GPI-APs sarong klase nin mga protina sa ibabaw kan selula na konektado sa lipid ( 6, 7). An GPI-AP sarong pigtatago na protina na nakadikit sa panluwas na mga leaflet kan plasma membrane sa paagi kan glycolipid moiety (GPI anchor). Inaako ninda an mga angkla kan GPI bilang konserbatibong mga modipikasyon pagkatapos kan pagsalin sa ER lumen (8). Pagkatapos kan pagdukot, an GPI-AP minaagi sa Golgi apparatus (5, 9) gikan sa ER pasiring sa plasma membrane. An presensya kan mga angkla kan GPI nagigin dahelan na an GPI-AP maitransportar na suway sa mga protina na pigtaluwas sa transmembrane (kaiba an ibang mga protina sa plasma membrane) sa agihan kan pagluwas (5, 9, 10). Sa mga selula nin lebadura, an mga GPI-AP pinagbubulag sa ibang mga sekretong protina sa endoplasmic reticulum, dangan pigbabalot sa mga pambihirang vesicle na pinatos kan coat protein complex II (COPII) (6, 7). An mga determinante kan proseso nin klasipikasyon na ini sa proseso nin pag-eksport kan ER bakong malinaw, alagad pig-iisip na an mekanismong ini pwedeng nangangaipo nin mga lipid, orog na an structural remodeling kan lipid portion kan GPI anchor (5, 8). Sa lebadura, an paghirahay kan lipid kan GPI nagpopoon tulos pagkatapos na magdukot an GPI, asin sa kadaklan na kaso, ini an nagigin dahelan kan ceramide na magbugkos sa 26-carbon long-chain saturated fatty acid (C26:0) (11, 12). An C26 ceramide iyo an mayor na ceramide na piggigibo kan mga selula nin lebadura sagkod ngonyan. Ini pig-synthesize sa ER asin kadaklan kaini pig-eeksportar sa Golgi apparatus sa paagi kan COPII vesicles (13). An ER export kan GPI-AP partikularmenteng nangangaipo nin padagos na paggibo nin ceramide (14, 15), asin sa huri, an pagkombertir kan ceramide pasiring sa inositol phosphate ceramide (IPC) sa Golgi apparatus nakadepende sa GPI anchor synthesis (16). An mga pag-aadal sa biopisikal na may artipisyal na mga lamad nagpahiling na an mga halabang marhay na acyl chain ceramides pwedeng magsararo tanganing makabilog nin mga ordered domain na may pambihirang pisikal na mga propyedad (17, 18). An mga datos na ini nagdara sa hipotesis na an C26 ceramide asin GPI-AP na may C26 ceramide ginagamit an saindang pisikal na mga propyedad tanganing magsararo sa mga aregladong rehiyon o mga rehiyon sa medyo maribok na ER membrane lipid environment. Ini mayormenteng kompuesto nin halipot asin bakong saturated glycerolipids (C16:1 asin C18:1) (19, 20). An mga rehiyon na ini pipilion na tutukan sa mga partikular na ER exit sites (ERES), kun saen an ceramide asin ceramide-based GPI-AP pwedeng i-co-transport sa Golgi sa parehong dedikado na COPII vesicle (5).
Sa pag-aadal na ini, direkta ming pigprobaran an mekanismong ini na nakabase sa lipid sa paagi kan paggamit nin super-resolution confocal real-time imaging microscopy (SCLIM), na sarong cutting-edge microscopy technique na pwedeng sabay na mag-obserbar nin mga protina na may tatak na fluorescent An mga imahe na may tolong kolor asin tolong dimensyon (3D) igwa nin labi-labing halangkaw na resolusyon asin rikas sa mga nabubuhay na selula (21, 21).
Enot ming pig-aplikar an teknolohiya kan SCLIM tanganing orog pang i-define kun pano an normal na GPI-AP na may C26 ceramide group pig-screen gikan sa mga transmembrane secreted proteins pagkatapos na maghale sa ER sa S. cerevisiae. Tanganing ma-check an klasipikasyon kan ER, naggamit kami nin sarong sistemang henetiko na direktang makakahiling nin bagong sintetikong kargamento na naglalaog sa ERES sa vivo (7, 23). Bilang kargamento, pinili niamo an C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 na may marka na berdeng fluorescent protein (GFP) asin transmembrane secreted protein Mid2 na may marka na near-infrared fluorescent protein (iRFP), na parehong nagtatarget sa plasma membrane (24–26). Sa sec31-1 na mutant na sensitibo sa temperatura, an duwang kargamentong ini ipinapahayag sa irarom kan sarong galactose-inducible promoter asin sarong konstitutibong ERES marker. Sa labi-labing temperatura (37°C), huli ta an sec31-1 mutation nakakaapektar sa pagpunsyon kan COPII coat component na Sec31 tanganing pugulan an COPII germination asin ER export, an bagong sintetikong kargamento nagtitipon sa ER (23). Pagkatapos na malipot sa hababang temperatura (24°C), an sec31-1 mutant cells nakabawi gikan sa secretory area, asin an natipon na bagong sintetikong kargamento nagpoon na iluwas gikan sa ER. An pag-imahinar kan CLIM nagpahiling na an kadaklan sa mga bagong pig-synthesize na Gas1-GFP asin Mid2-iRFP nagtipon pa man giraray sa ER kan sec31-1 mutant cells pagkatapos kan pag-inkubar sa 37°C asin dangan pinaluwas sa 24°C sa laog nin 5 minutos (Figure 1). Nin huli ta an Mid2-iRFP nakawarak sa bilog na ER membrane, asin an Gas1-GFP nakakonsentrar asin nakatipon sa discontinuous ER membrane area, an saindang distribusyon biyong iba (Figure 1, A sagkod C asin Movie S1). Dugang pa, siring sa ipinapahiling sa Figure 1D, an Gas1-GFP cluster mayo nin Mid2-iRFP. An mga resultang ini nagpapahiling na an GPI-AP asin mga protina sa transmembrane pinagsuhay sa manlaen-laen na rehiyon kan ER membrane nin amay. An Gas1-GFP cluster kataid kan sarong espesipikong ERES na may markang mCherry's COPII coat protein Sec13 (Figure 1, E asin F, asin pelikula S1) (23).
an mga selula kan sec31-1 nagpapahayag nin mga sekreto na pinukaw nin galactose, sarong halawig na kadena nin acyl (C26) ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, berde) asin an transmembrane na protina na Mid2-iRFP (TMP, asul) asin ining Constructive ERES labeling Sec13-mCherry (E) pig-incubate para sa 30°C minutos, ibinalyo sa 24°C, asin pig-imahe kan SCLIM 5 minutos an nakaagi. (A sagkod C) nagpapahiling nin sarong representanteng pinagsararo o solong 2D na imahe nin sarong eroplano (A), sarong 2D na imahe nin proyeksiyon nin 10 z-seksyon (B) o sarong 3D na imahe kan hemisphere kan selula nin mga kargamento asin ERES markers (C). Scale bar 1μm (A asin B). An yunit kan sukol 0.551μm (C). An Gas1-GFP nadetektaran sa mga diskretong rehiyon o mga kumpol kan ER, mantang an Mid2-iRFP nadetektaran asin naiwaras sa bilog na ER membrane (C). (D) An graph nagpapahiling kan relatibong intensidad kan fluorescence kan Gas1-GFP asin Mid2-iRFP sa Gas1-GFP cluster sa kahalabaan kan puting linya nin pana (wala). AU, arbitraryong yunit. (E asin F) nagrerepresentar kan 3D na imahe na pinagsasaro an mga paninda asin marka kan ERES. An mga grupo nin Gas1-GFP nadetektaran harani sa espesipikong ERES. An yunit kan sukol 0.551μm. (F) An puting solidong arrow minamarka kan Gas1-GFP cluster na may koneksyon sa ERES. An tahaw asin too na mga panel nagpapahiling kan pinagsararong pinadakula na 3D na imahe asin sarong pinaikot na paghiling kan piniling Gas1-GFP cluster.
An haraning relasyon sa espasyo sa pag-ultanan kan Gas1-GFP cluster asin sarong espesipikong ERES nagpapahiling na an Gas1-GFP pwedeng maglaog sa selective ERES, na iba sa selectivity na ginagamit kan Mid2-iRFP tanganing magluwas sa ER. Tanganing masimbagan an posibilidad na ini, pig-quantify niamo an ERES ratio para sa saro o duwang paninda sana (Figure 2, A sagkod C). Nanompongan niamo na an kadaklan na ERES (70%) igwa sana nin sarong klase nin kargamento. An imahe sa ibaba kan Figure 2C nagpapahiling nin duwang tipikal na halimbawa nin ERES na may Gas1-GFP sana (Figure 1) o Mid2-iRFP sana (Figure 2). Sa kabaliktaran, mga 20% kan ERES igwa nin duwang kargamento na nag-oorolay sa parehong lugar. Nadiskubre na an nagkapirang ERES (10%) igwa nin duwang klase nin kargamento, alagad sinda nakasuhay sa malinaw na magkaibang lugar. Kaya, an estadistikal na pag-analisar na ini nagpapahiling na pagkatapos na an ER i-export, an GPI-AP Gas1-GFP asin an transmembrane cargo Mid2-iRFP nababanga sa manlaen-laen na ERES (Figure 2D). An kahusayan sa pag-sort na ini magkapareho nanggad sa nakaaging pag-analisar sa biokemikal (6) asin determinasyon sa morpolohiya (7). Puede man niatong maobserbaran an gawe-gawe kan mga naka-quarantine na kargamento na naglalaog sa ERES (Figure 2E asin Movie S2). Ipinapahiling kan Pigura 2E na sadit sanang porsyon kan Gas1-GFP (panel 3) o Mid2-iRFP (panel 4) an minalaog sa ERES gikan sa sarong lado asin nakakulong sa sarong diskretong lugar. An Panel 5 kan Figure 2E nagpapahiling na an Gas1-GFP asin Mid2-iRFP minsan makukua sa parehong ERES, alagad sinda minalaog gikan sa manlaen-laen na lado asin nakakonsentrar sa magkasuhay na mga rehiyon na pwedeng magrepresentar nin manlaen-laen na COPII vesicles. Kinumpirmar man niamo na an naobserbaran na pagbubulag asin klasipikasyon kan C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 bilang selective ERES espesipiko huli ta an saro pang transmembrane secretion cargo, an GFP-tagged plasma membrane protein Axl2 (27 ), na nagpapahiling nin kaparehong gawi-gawi sa Mid2-iRFP. (Ladawan S1 asin Pelikula S3). An bagong pig-synthesize na Axl2-GFP ipinapamahagi sa paagi kan ER membrane arog kan Mid2-iRFP (Figure S1, A asin B), asin naka-co-localize sa Mid2-iRFP sa kadaklan na ERES (Figure S1, B sagkod D). An mga panel 1 asin 2 kan Pigura 1. An S1C nagpapahiling nin duwang tipikal na halimbawa kan ERES kun saen an duwang transmembrane cargoes nag-oorolay. Sa mga kasong ini, an duwang paninda magkaibanan na minalaog sa ERES (Figure S1E, Panel 3 asin Movie S3).
An mga sec31-1 na selula na nagpapahayag nin mga galactose inducible secretions, Gas1-GFP (GPI-AP, berde) asin Mid2-iRFP (TMP, asul) asin konstitutibong ERES na nagmarka kan Sec13-mCherry (ERES, magenta) ibinugtak sa 37 Pagkatapos na mag-inkubar sa laog nin 30 minutos sa °C, 24, ion pasiring sa pagluwas sa imahe sa SCLIM pagkatapos nin 20 minutos. (A sagkod C) Representatibong 2D na mga imahe nin proyeksiyon (A; scale bar, 1μm) o 3D na mga imahe kan hemisphere kan selula (B asin C; scale unit, 0.456μm) kan kargamento asin 10 z-sections na minarkahan nin ERES. An ibabang panel sa (B) asin an panel sa (C) nagpapahiling nin mga naprosesong imahe tanganing ipahiling sana an mga paninda na yaon sa ERES (magenta) [Gas1-GFP (abo) asin Mid2-iRFP (light blue)]. (C) Bukas na pana: An ERES nagdadara sana nin sarong pidaso nin kargamento (1 sagkod 4). Abohon na pana: An ERES igwa nin separadong kargamento (5). Puting solidong pana: ERES na igwa nin mga kargamento na magkaibanan. Sa ibaba: An piniling solong ERES igwa sana nin Gas1-GFP (1) o Mid2-iRFP (2). Scale bar, 100 nm. (D) Pagkwantipika kan photomicrograph na ilinadawan sa (C). An average na porsyento kan ERES na igwa sana nin sarong kargamento (Gas1-GFP o Mid2-iRFP), pinagsuhay na kargamento asin nag-oorog na kargamento. Sa tolong independienteng eksperimento, n=432 sa 54 na selula. Error bar = SD. Duwang-ikog na daing pares na t test. *** P = 0.0002. (E) 3D na imahe kan piniling ERES kan mga kargamentong naka-quarantine na may markang (C). An Gas1-GFP (berde) (3) o Mid2-iRFP (asul) (4) minalaog sa ERES (magenta) gikan sa sarong lado asin limitado sa sarong sadit na lugar sa laog kan ERES. Minsan, an duwang klase nin kargamento minalaog sa parehong ERES (5) gikan sa parehong lado asin nakakulong sa sarong isoladong lugar sa laog kan ERES. Scale bar, 100 nm.
Sunod, pigtestingan niamo an sarong hipotesis na an halawig na acyl chain ceramide (C26) na yaon sa ER membrane an nagtutulod kan espesipikong pag-cluster asin pag-sort kan Gas1 sa selective ERES. Sa katuyuhan na ini, naggamit kami nin sarong pigbago na strain nin lebadura na GhLag1, kun saen an duwang endogenous ceramide synthases na Lag1 asin Lac1 sinalidahan kan GhLag1 (an Lag1 homolog kan gapas), na nagresulta sa sarong strain nin lebadura na may cell membrane Ceramide strain na mas halipot kisa wild type (Figure 3A) (28). An pag-analisar kan mass spectrometry (MS) nagpahiling na sa mga strain na wild-type, 95% kan total na ceramide halawig na marhay (C26) na kadena nin ceramide, mantang sa GhLag1, 85% kan ceramide halawig na marhay (C18 asin C16). ), 2% sana kan ceramide an halawig na marhay (C26) na kadena nin ceramide. Dawa ngani an C18 asin C16 ceramides iyo an mga mayor na ceramide na nadetektar sa GhLag1 membrane sagkod ngonyan, an pag-analisar kan MS nagkumpirma man na an GPI anchor kan Gas1-GFP na ipinahayag sa GhLag1 strain igwa nin C26 ceramide, na maikukumpara sa wild-type lipids. Pareho an kalidad (Fig. 3A) (26). Kaya, ini nangangahulugan na an ceramide remodeling enzyme Cwh43 halangkaw an pagpili para sa C26 ceramide, siring sa ipinapahiling sa Figure 26, ini mas gustong maglaog kan GPI anchor gikan sa sadit na kantidad nin C26 ceramide sa GhLag1 strain. S2 (29). Dawa siring, an lamad kan selula kan GhLag1 igwa sana nin C18-C16 ceramide, mantang an Gas1-GFP igwa pa man giraray nin C26 ceramide. An bagay na ini ginigibo an strain na ini na sarong ideyal na kasangkapan tanganing partikularmenteng masolusyunan an problema kan laba kan acyl chain kan membrane ceramide sa ER. An hypothetical na papel kan klase asin pag-sort. Dangan, enot ming pinag-adalan an kakayahan kan C26 Gas1-GFP na magtipon sa mga kumpol sa GhLag1 na may sarong temperatura-sensitibo na mutant allele kan sec31-1 sa paagi nin kombensyonal na fluorescence microscopy, kun saen an halawig (C18-C16) na kadena sana an yaon sa ER membrane Ceramide (Fig. 3). Naobserbaran niamo na sa sec31-1, kadaklan kan Gas1-GFP nakakonsentrar sa mga kumpol, mantang an Gas1-GFP sa sec31-1 GhLag1 na may halawig (C18-C16) halawig na ceramide ER membrane mayormenteng dai nakagrupo asin nakadistribwir sa Sa bilog na ER membrane. Tanganing magin eksakto, huli ta an C26 ceramide-based clustering harani sa partikular na ERES (Figure 1), sunod niamong inimbestigaran kun baga an prosesong ini pwede man na imbuelto an pagpunsyon kan ER export protein mechanism. An GPI-AP naggagamit nin sarong espesyal na sistema nin COPII para sa pagluwas kan ER, na aktibong pigreregular kan Ted1′s structural remodeling kan glycan portion kan GPI anchor (30, 31). An recombinant GPI-glycan dangan namimidbid kan transmembrane cargo receptor p24 complex, na sa huri pinipili an Lst1, na sarong espesipikong isoform kan mayor na COPII cargo binding subunit na Sec24, na nagpoporma nin sarong GPI-AP-rich COPII Vesicles are necessary (31-33). Kaya, nagkonstruhir kami nin dobleng mutant na pinagsararo an paghale kan mga solong protina na ini (an p24 complex component Emp24, GPI-glycan remodeling enzyme Ted1 asin an espesipikong COPII subunit Lst1) sa sec31-1 mutant strain, asin pinag-adalan sinda Posible daw na makabilog nin Gas1-cluster GFP (Figure 3). Naobserbaran niamo na sa sec31-1emp24Δ asin sec31-1ted1Δ, an Gas1-GFP mayormenteng dai nakagrupo asin nakawaras sa bilog na ER membrane, siring sa dati nang nahiling sa sec31-1 GhLag1, mantang sa sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Arog kan sec31-1-11. An mga resultang ini nagpapahiling na dugang pa sa presensya kan C26 ceramide sa ER membrane, an pag-cluster kan Gas1-GFP kaipuhan man na magbugkos sa p24 complex, asin dai nangangaipo nin espesipikong Lst1 recruitment. Dangan, pig-eksplorar niamo an posibilidad na an laba kan kadena kan ceramide sa ER membrane pwedeng magregulate kan pagbugkos kan Gas1-GFP sa p24. Alagad, nanompongan niamo na an presensya kan C18-C16 ceramide sa lamad dai nakakaapektar sa GPI-glycans na pigkonstruhir liwat kan p24 complex (Mga Pigura S3 asin S4, A asin B) o pagbugkos sa GPI-AP asin pag-eksportar kan GPI-AP. kakayahan. Magrekrut kan COPII subtype Lst1 (Figure S4C). Kaya, an C26 ceramide-dependent clustering dai nangangaipo nin mga interaksiyon sa protina sa manlaen-laen na mekanismo nin protina sa pagluwas kan ER, alagad nagsusuporta sa sarong alternatibong mekanismo nin pag-sort na pinapaandar kan laba kan lipid. Dangan, inaanalisar niamo kun baga an laba kan kadena nin ceramide acyl sa ER membrane importante para sa epektibong klasipikasyon kan Gas1-GFP bilang selective ERES. Nin huli ta an Gas1 sa GhLag1 strain na may short-chain ceramide minaluwas sa ER asin minalaog sa plasma membrane (Figure S5), nagtutubod kami na kun an pag-sort pinapaandar kan laba kan ceramide acyl chain, an Gas1 sa GhLag1 strain pwedeng i-redirect asin i-cross. Mga paninda kan ERES na may parehong lamad.
(A) An membrane kan selula kan GhLag1 mayormenteng igwa nin mas halipot na C18-C16 ceramides, mantang an GPI anchor kan Gas1-GFP igwa pa man giraray kan parehong C26 IPC bilang mga wild-type na selula. Sa itaas: pag-analisar kan laba kan kadena nin acyl kan ceramide sa lamad kan selula kan wild-type (Wt) asin GhLag1p na mga strain sa paagi nin mass spectrometry (MS). An datos nagrerepresentar kan porsyento kan total na ceramide. An average kan tolong independienteng eksperimento. Error bar = SD. Duwang-ikog na daing pares na t test. **** P ＜0.0001. Ibaba na panel: MS analysis kan acyl chain length kan IPC na yaon sa Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI anchor na ipinahayag sa wild-type asin GhLag1p strains. An datos nagrerepresentar kan porsyento kan total na signal kan IPC. Average kan limang independienteng eksperimento. Error bar = SD. Duwang-ikog na daing pares na t test. ns, bakong mahalaga. P = 0.9134. (B) An mga mikrograpo nin fluorescence kan sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ asin sec31-1lst1Δ na mga selula na nagpapahayag nin galactose-induced Gas1-GFP pig-inkubar sa 37°C sa laog nin 30 minutos asin nag-agi nin fluorescence mikroskopyo pagkatapos kan 24°C. Puting pana: ER Gas1-GFP cluster. Bukas na pana: An dai nakagrupo na Gas1-GFP ipinapamahagi sa bilog na lamad kan ER, na nagpapahiling kan karakteristiko kan ER na pagmantsa kan nukleyar na singsing. Scale bar, 5μm. (C) Pagkwantipika kan photomicrograph na ilinadawan sa (B). An average na porsyento kan mga selula na may punctate Gas1-GFP na estruktura. Sa tolong independienteng eksperimento, n≥300 na mga selula. Error bar = SD. Duwang-ikog na daing pares na t test. **** P ＜0.0001.
Tanganing direktang masolusyunan an problemang ini, ginibo niamo an SCLIM visualization kan Gas1-GFP asin Mid2-iRFP sa GhLag1 na may sec31-1 temperature-sensitive mutant allele (Figure 4 asin Movie S4). Pagkatapos na an ER napagdanay sa 37°C asin sunod na pinaluwas sa 24°C, kadaklan kan bagong na-synthesize na Gas1-GFP dai na-cluster asin naiwaras sa bilog na ER membrane, siring sa naobserbaran kan mga kombensyonal na mikroskopyo (Figure 4, A asin B ). Dugang pa, an dakulang porsyento kan ERES (67%) kabali an duwang klase nin kargamento na magkaibanan na yaon digdi (Figure 4D). An mga panel 1 asin 2 kan Figure 4C nagpapahiling nin duwang tipikal na halimbawa kan ERES na may magkakaparehong Gas1-GFP asin Mid2-GFP. Dugang pa, an duwang paninda pigrekrut sa parehong ERES (Figure 4E, panel 3 asin pelikula S4). Kaya, an samong mga resulta nagpapahiling na an laba kan ceramide acyl chain sa ER membrane sarong importanteng determinante kan ER protein aggregation asin klasipikasyon.
Sec31-1 GhLag1 cells na nagpapahayag nin mga sekreto na pinukaw nin galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, berde) asin Mid2-iRFP (TMP, asul) asin konstitutibong ERES-labeled Sec13-mCherry (ERES, magenta) Mag-inkubar sa 37°C. Padagos sa laog nin 30 minutos, ihulog sa 24°C tanganing magpaluwas nin mga sekreto, asin imahe gamit an SCLIM pagkatapos nin 20 minutos. (A sagkod C) Representatibong 2D na mga imahe nin proyeksiyon (A; scale bar, 1μm) o 3D na mga imahe kan hemisphere kan selula (B asin C; scale unit, 0.45μm) kan 10 z-sections na minarkahan nin kargamento asin ERES. An ibabang panel sa (B) asin an panel sa (C) nagpapahiling nin mga naprosesong imahe tanganing ipahiling sana an mga paninda na yaon sa ERES (magenta) [Gas1-GFP (abo) asin Mid2-iRFP (light blue)]. (C) Puting pano na pana: ERES, mga paninda na nag-oorolay. Bukas na pana: An ERES igwa sana nin sarong bagay. Ibabang panel: An piniling ERES igwa nin mga nag-oorog na mga paninda (1 asin 2) na minarkahan sa (C). Scale bar, 100 nm. (D) Pagkwantipika kan photomicrograph na ilinadawan sa (C). Sa mga yunit kan sec31-1 asin sec31-1 GhLag1, saro sanang kargamento (Gas1-GFP o Mid2-iRFP) an kabali, asin an average na porsyento kan ERES para sa nakasuhay na kargamento asin magkakaparehong kargamento. Sa tolong independienteng eksperimento, n = 432 sa 54 na selula (sec31-1) asin n = 430 sa 47 na selula (sec31-1 GhLag1). Error bar = SD. Duwang-ikog na daing pares na t test. *** P = 0.0002 (sec31-1) asin ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D na imahe kan piniling ERES na may nag-oorog na kargamento (3) na minarkahan sa (C). An Gas1-GFP (berde) asin Mid2-iRFP (asul) minadolok sa ERES (magenta) gikan sa parehong lado asin nagdadanay sa parehong ERES restricted area. Scale bar, 100 nm.
An pag-aadal na ini nagtatao nin direktang in vivo na ebidensya na an mga kargamento nin protina na nakabase sa lipid pigklasipikar sa mga selective export sites sa secretory pathway, asin nagpapahiling kan importansya kan acyl chain length para sa classification selectivity. Gamit an sarong mapuwersang asin pinakabagong teknika sa mikroskopyo na inaapod na SCLIM, ipinaheling niamo an bagong pinag-synthesize na Gas1-GFP (sarong mayor na plasma membrane GPI-AP na may halawig na marhay na acyl chain (C26) ceramide lipid portion) sa lebadura) An mga rehiyon na nakagrupo sa mga diskretong ERs asosyado sa mga espesipikong ERES, mantang an transmembrane na protina ipinapasa sa paagi kan ERRES na protina (Figure 1). Dugang pa, an duwang klaseng ini nin mga paninda minalaog sa manlaen-laen na ERES nin pili (Figure 2). An acyl chain length kan cellular ceramide sa membrane nabawasan poon C26 sagkod C18-C16, an Gas1-GFP cluster nadisturbo sa discrete ER region, asin an Gas1-GFP na-reroute tanganing maghale sa ER kaiba an transmembrane protein sa paagi kan parehong ERES (Figure 3 asin Figure 3). 4).
Dawa ngani an GPI-AP naggagamit nin sarong espesyalisadong mekanismo nin protina tanganing makaluwas sa ER, nanompongan niamo na an C26 ceramide-dependent separation dai nakadepende sa mga interaksiyon nin protina na pwedeng magdara sa espesyalisasyon kan ERES (Mga Pigura S4 asin S5). Imbes, an samong mga nadiskubre nagsusuporta sa sarong alternatibong mekanismo nin klasipikasyon na pinapaandar kan lipid-based protein clustering asin an kasunod na pag-eksklusibo kan ibang mga kargamento. An samong mga obserbasyon nagpapahiling na an Gas1-GFP na rehiyon o cluster na may relasyon sa sarong espesipikong ERES kulang sa transmembrane secreted protein Mid2-iRFP, na nagpapahiling na an C26 ceramide-dependent GPI-AP cluster magpapadali kan saindang paglaog sa nanonongdan na ERES, asin kasabay kaini, dai kabali an transmembrane An mga sekreto minalaog sa partikular na ERES na ini (Mga Pigura 12 asin RES). Sa kabaliktaran, an presensya kan C18-C16 ceramides sa ER membrane dai nagigin dahelan kan GPI-AP na magbilog nin mga rehiyon o mga kumpol, kaya dai ninda pig-iiba o pigbabalyo an mga transmembrane secreted proteins sa parehong ERES (Mga Pigura 3 asin 4). . Kaya, pigproponer niamo na an C26 ceramide an nagtutulod kan pagbubulag asin klasipikasyon sa paagi nin pagpadali kan pag-iriba kan mga protina na konektado sa partikular na ERES.
Paano makakamtan an C26 ceramide-dependent clustering na ini sa sarong partikular na lugar kan ER? An tendensiyang an membrane ceramide na magsuhay sa gilid pwedeng magin dahelan kan GPI-AP asin C26 ceramide na magbilog nin saradit asin tulos na nakasunod na mga lipid sa mas iregular na lipid na kapalibutan kan ER membrane na igwa nin mas halipot asin unsaturated glycerolipids. Mga kumpol nin kalidad (17, 18). An saradit na temporaryong mga kumpol na ini pwedeng orog pang ipagsararo sa mas darakula, mas estableng mga kumpol pagkatapos na magbugkos sa p24 complex (34). Susog kaini, ipinaheling niamo na an C26 Gas1-GFP kaipuhan na makipag-ulay sa p24 complex tanganing makabilog nin mas darakulang nahihiling na mga grupo (Figure 3). An p24 complex sarong heterozygous oligomer na kompuesto nin apat na manlaen-laen na p24 transmembrane proteins sa lebadura (35), na nagtatao nin multivalent binding, na pwedeng magdara sa cross-linking kan saradit na GPI-AP clusters, sa siring nagbubunga nin mas dakulang Stable cluster (34). An interaksiyon sa pag-ultanan kan mga ectodomain kan protina kan GPI-APs pwede man na makakontribwir sa saindang pag-iriba, siring sa ipinapahiling sa panahon kan saindang transportasyon sa Golgi sa mga selula nin epithelial na polarisadong mamalya (36). Alagad, kun an C18-C16 ceramide yaon sa ER membrane, kun an p24 complex nagbubugkos sa Gas1-GFP, an darakulang separadong mga grupo dai mapoporma. An nakatagong mekanismo pwedeng magdepende sa mga partikular na pisikal asin kemikal na mga propyedad kan halawig na acyl chain ceramide. An mga pag-aadal sa biopisikal kan mga artipisyal na lamad nagpapahiling na dawa ngani an parehong halawig (C24) asin halipot (C18-C16) na mga acyl chain ceramide pwedeng magcausa nin pagbubulag kan yugto, an halawig na acyl chain ceramides (C24) sana an pwedeng mag-promote nin halangkaw na Curvature asin film bending tanganing mabago an porma kan pelikula. Sa paagi nin magkaparehong pagsambit (17, 37, 38). Ipinaheling na an transmembrane helix kan TMED2, an human homologue kan Emp24, piniling nakikipag-interak sa C18 ceramide-based sphingomyelin sa mga cytoplasmic lobules (39). Gamit an mga simulation kan molecular dynamics (MD), nanompongan niamo na an parehong C18 asin C26 ceramides nagtitipon sa palibot kan mga cytoplasmic lobules kan Emp24 transmembrane helix, asin igwa sinda nin kaparehong mga kagustuhan (Figure S6). Mahalagang mangnohon na ini nagpapahiling na an transmembrane helix kan Emp24 pwedeng magresulta sa asimetrikong distribusyon kan mga lipid sa lamad. Ini sarong bagong resulta base sa mga selula nin mamalya. An kaparehong mga simulation kan MD nagpapahiling man kan presensya kan mga ether lipid (40) . Kaya, pig-iisip niamo na an C26 ceramide sa duwang lobule kan ER26 lokal na pinayaman. Kun an GPI-AP sa mga luminal lobules direktang nagbubugkos sa multivalent p24 asin an pagtipon kan C26 ceramide sa palibot kan p24 sa mga cytoplasmic lobules, ini makakapagpauswag kan kaibang Protein aggregation asin membrane curvature nagigibo sa paagi kan mga moro (41), na nagigin dahelan kan GPI-AP na magbulag sa mga diskretong rehiyon na kataid kan E, na nagpapabor man sa halangkaw na kurbadong mga rehiyon an ER membrane (42). An mga nakaaging report nagsuporta sa propuestong mekanismo (43, 44). An multivalent na pagbugkos kan mga oligolectin, pathogen o antibodies sa ceramide-based glycosphingolipids (GSL) sa plasma membrane nagbubunga nin dakulang GSL aggregation, nagpapauswag kan pagbubulag kan yugto asin nagigin dahelan nin deformation asin internalisasyon kan membrane (44). Iwabuchi asin iba pa. (43) Nadiskubre na sa presensya kan halawig (C24) alagad bakong halipot (C16) na mga kadena nin acyl, an multivalent ligand na nakabugkos sa GSL lactosylceramide nag-induce kan pagporma nin darakulang kumpol asin paglaog kan lamad, asin an cytoplasm Lyn-mediated signal transduction sa mga leaflet pig-iinterbitar kan mga neutrophil chain na magkapareha.
Sa mga mammalian polarized epithelial cells, an konsentrasyon kan anti-Golgi network (TGN) sa lebel kan apical plasma membrane iyo an nagkokontrol kan pagbubulag asin pag-sort kan GPI-AP (10, 45). An pag-iriba na ini pinapaandar kan GPI-AP oligomerization (36), alagad pwede man ining magdepende sa laba kan kadena nin ceramide na makukua ta sa lebadura. Dawa ngani an mammalian GPI-AP igwa nin ether lipid-based anchor, asin an kemikal na estruktura kaini laen na gayo sa halawig na marhay na acyl chain ceramide, sarong dai pa sana nahahaloy na pag-aadal an nakadiskubre na an duwang lipid igwa nin kaparehong pisikal asin kemikal na mga propyedad asin pagpunsyon sa ebolusyon (40). Kaya, an parte kan ether lipid sa mga selula nin mammal pwedeng kapareho kan C26 ceramide sa lebadura, asin an papel kaini iyo an makisumaro sa long-chain ceramide sa membrane tanganing maipalakop an GPI-AP aggregation asin pag-sort. Dawa ngani an posibilidad na ini kaipuhan pa man giraray na direktang baloon, an mga nakaaging nadiskubre nagsusuportar na an transportasyon kan halawig na kadena nin acyl ceramide pasiring sa hawak ni Golgi dai ginigibo kan mga protina sa pagbalyo kan cytoplasm, kundi nakadepende sa paggibo nin mga angkla kan GPI arog kan lebadura. Kaya, an ebolusyonaryong konserbatibong mekanismo garo baga kayang pilion na mag-co-transport nin halawig na marhay na acyl chain ceramide asin GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) sa parehong transport vesicle.
Sa mga sistema nin selula nin epithelial na may polarisasyon sa lebadura asin mamalya, an pag-iriba kan GPI-AP asin an pagbubulag sa ibang mga protina kan plasma membrane gabos nangyayari bago makaabot sa ibabaw kan selula. Paladino asin iba pa. (48) nadiskubre na sa TGN kan mga mammalian polarized epithelial cells, an GPI-AP clustering bako sanang kaipuhan para sa piniling klasipikasyon kan GPI-APs sa apical plasma membrane, kundi nagreregular man kan clustering organization kan GPI-APs asin an biyolohikong aktibidad kaini. Ibabaw kan selula. Sa lebadura, an pag-aadal na ini nagpahiling na an C26 ceramide-dependent GPI-AP cluster sa ER pwedeng magregulate kan organisasyon kan cluster asin functional activity kan GPI-AP sa plasma membrane (24, 49). Susog sa modelong ini, an mga selula nin GhLag1 alerdyik sa mga inhibitor kan GPI o mga droga na nakakaapektar sa integridad kan lanob kan selula (28), asin an pangangaipo para sa mga functional na Gas1-GFP clusters (49) kan tip ceramide na pigproyekto sa pag-agom kan mga selula nin lebadura nagpapahiling nin G� Posibleng mga resulta sa pisyolohiya kan mga selula nin hLag1. GPI-AP error. Alagad, an dugang pang pag-eksamin kun baga an functional na organisasyon kan ibabaw kan selula naprograma gikan sa ER sa paagi nin sarong paagi nin pag-sort base sa laba kan lipid iyo an magigin tema kan samong pagsiyasat sa maabot na panahon.
An mga strain kan Saccharomyces cerevisiae na ginamit sa trabahong ini nakalista sa Table S1. An MMY1583 asin MMY1635 na mga strain kan SCLIM para sa live cell imaging ginibo sa likod kan W303. An mga strain na ini na nagpapahayag nin Sec13-mCherry na may fluorescent protein tag pigkonstruhir gamit an sarong polymerase chain reaction (PCR)-based na paagi na may pFA6a plasmid bilang sarong template (23). An strain na nagpapahayag nin Mid2-iRFP na may markang fluorescent protein sa irarom kan kontrol kan GAL1 promoter pigkonstruhir sa minasunod. PCR amplification kan iRFP-KanMx sequence gikan sa pKTiRFP-KAN vector (regalo ni E. O'Shea, Addgene plasmid number 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; research resource identifier (RRID): Addgene_64687) Asin isinuksok sa C endous-endous kan Midgenous. Pagkatapos na an Mid2-iRFP genome sequence pinakusog asin pig-clone sa GAL1 promoter, ini pig-integrar sa Not I-Sac I site kan integration plasmid pRS306. An nagresultang plasmid pRGS7 pig-linearize sa Pst I tanganing maibugtak sa URA3 locus.
An Gas1-GFP fusion gene ipinapahayag sa irarom kan kontrol kan GAL1 promoter sa centromere (CEN) plasmid, na pigkonstruhir arog kan minasunod. An Gas1-GFP sequence pinakusog sa paagi nin PCR gikan sa pRS416-GAS1-GFP plasmid (24) (regalo ni L. Popolo) asin pig-clone sa Xma I–Xho I site kan CEN plasmid pBEVY-GL LEU2 (regalo ni C) . Miller; Addgene plasmid number 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). An nagresultang plasmid nginaranan na pRGS6. An Axl2-GFP fusion gene ipinapahayag man sa irarom kan kontrol kan GAL1 promoter kan pBEVY-GL LEU2 vector, asin an konstruksyon kaini iyo an minasunod. An Axl2-GFP sequence pig-amplify gikan sa pRS304-p2HSE-Axl2-GFP plasmid (23) sa paagi nin PCR, asin pig-clone sa Bam HI-Pst I site kan pBEVY-GL LEU2 vector. An nagresultang plasmid nginaranan na pRGS12. An pagkasunod-sunod kan mga oligonucleotide na ginamit sa pag-aadal na ini nakalista sa Table S2.
An strain pigdagdagan nin 0.2% adenine asin 2% glucose [YP-dextrose (YPD)], 2% raffinose [YP-raffinose] mayaman na yeast extract protein p (YP) medium (1 % Yeast extract asin 2% protein ept). (YPR)] o 2% galactose [YP-galactose (YPG)] bilang sarong pinagkukuanan nin karbon, o sa sarong sintetikong minimal na medium (0.15% yeast nitrogen base asin 0.5% ammonium sulfate) tanganing dagdagan an maninigong mga amino acid asin base na kaipuhan para sa nutrisyon, Asin igwa nin 2% glucose (2% glucose glucose) o minimal na medium galactose (sintetikong galactose minimal medium) bilang sarong pinagkukuanan nin karbon.
Para sa real-time imaging, an mga sec31-1 mutant cells na sensitibo sa temperatura na nagpapahayag kan construct sa irarom kan GAL1 promoter pinadakula sa YPR medium sa 24°C sa bilog na banggi sagkod sa mid-log phase. Pagkatapos kan induksyon sa YPG sa 24°C sa laog nin 1 oras, an mga selula pig-inkubar sa SG sa 37°C sa laog nin 30 minutos, dangan ibinalyo sa 24°C tanganing makaluwas sa bloke nin pagluwas. An Concanavalin A ginamit sa pag-ayos kan mga selula sa sarong slide na salming asin pig-imahe kan SCLIM. An SCLIM sarong kombinasyon kan Olympus IX-71 inverted fluorescence microscope asin UPlanSApo 100×1.4 numerical aperture oil lens (Olympus), high-speed asin high-signal-to-noise ratio rotating disc confocal scanner (Yokogawa Electric), custom spectrometer, intensiveing ​​systems asin mga imahe kan sistema (Hamamatsu Photonics) pwedeng magtao nin sistema nin magnifying lens na may pinal na magnification na ×266.7 asin sarong charge-coupled device camera na nagpapadakol nin mga elektron (Hamamatsu Photonics) (21). An pagkua nin imahe ginigibo sa paagi nin pasadyang software (Yokogawa Electric). Para sa mga 3D na imahe, naggamit kami nin sarong custom-made na piezoelectric actuator tanganing mag-vibrate an objective lens nin patindog, asin tinipon an mga optical parts na 100 nm an rayo sa sarong stack. An Z-stack na imahe pigkokombertir sa 3D voxel data, asin an teoretikal na point spread function na ginagamit para sa rotating disc confocal microscope ginagamit para sa pagproseso nin deconvolution kan Volocity software (PerkinElmer). Sa paggamit kan Volocity software tanganing awtomatikong mag-threshold para sa pag-analisar kan co-location, an ERES kaiba an kargamento sinusukol. An pag-analisar kan linya nin pag-scan ginibo gamit an MetaMorph software (Molecular Devices).
Gamiton an GraphPad Prism software tanganing madeterminaran an estadistikal na kahulugan. Para sa two-tailed Student's t-test asin an ordinaryong one-way analysis of variance (ANOVA) test, an mga pagkakaiba sa pag-ultanan kan mga grupo pigkokonsiderar na igwa nin mahalagang epekto sa P <0.05 (*).
Para sa fluorescence microscopy kan Gas1-GFP, an mga log phase cells pinadakula sa bilog na banggi sa YPD asin tinipon sa paagi nin centrifugation, hinugasan nin duwang beses gamit an phosphate buffered saline, asin pig-inkubar sa yelo sa laog nin dai mababa sa 15 minutos, dangan ipinadagos sa irarom kan mikroskopyo siring sa dati nang ipinaliwanag Check (24). An Leica DMi8 microscope (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) na igwa nin objective lens, L5 (GFP) filter, Hamamatsu camera asin Application Suite X (LAS X) software an ginamit para sa pagkua. .
An mga sample pig-denatured gamit an SDS sample buffer sa 65°C sa laog nin 10 minutos, dangan pinagsuhay gamit an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Para sa pag-analisar nin immunoblotting, 10 μl nin sample an pigkarga kada lane. Pangenot na antibody: Gamiton an rabbit polyclonal anti-Gas1 sa dilution na 1:3000, rabbit polyclonal anti-Emp24 sa dilution na 1:500, asin rabbit polyclonal anti-GFP (sarong regalo hale ki H. Riezman) sa dilution na 1:3000. An mouse monoclonal anti-Pgk1 antibody ginamit sa dilution na 1:5000 (sarong regalo gikan ki J. de la Cruz). Ikaduwang antibody: Horseradish peroxidase (HRP) conjugated goat anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) na ginamit sa dilution na 1:3000 (Pierce). An HRP-conjugated goat anti-mouse IgG ginamit sa sarong dilution na 1:3000 (Pierce). An sona nin pagsimbag sa resistensya naobserbaran sa paagi kan paagi nin chemiluminescence kan SuperSignal West Pico reagent (Thermo Fisher Scientific).
Siring sa ipinapaliwanag sa (31), sarong natural na eksperimento sa immunoprecipitation an ginibo sa pinayaman na ER fraction. Sa halipot na tataramon, hugasan an mga selula nin lebadura gamit an TNE buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride asin protease inhibitor mixture) sa 600 nm ( OD600) sa 100 optical density duwang beses. Ini binaak gamit an mga kuwintas na salming, dangan an mga ati kan selula asin mga kuwintas na salming hinale sa paagi nin sentrifugasyon. An supernatant dangan pig-centrifuge sa 17,000 g sa laog nin 15 minutos sa 4°C. An pellet pigsuspinde giraray sa TNE asin an digitalis saponin idinagdag sa huring konsentrasyon na 1%. An suspensyon pig-inkubar sa laog nin 1 oras na may pag-ikot sa 4°C, dangan an mga dai natutunaw na mga sangkap hinale sa paagi nin sentrifugasyon sa 13,000 g sa 4°C sa laog nin 60 minutos. Para sa Gas1-GFP immunoprecipitation, enot na i-pre-incubate an sample na may mga daing laog na agarose beads (ChromoTek) sa 4°C sa laog nin 1 oras, dangan i-incubate sa GFP-Trap_A (ChromoTek) sa 4°C sa laog nin 3 oras. An mga immunoprecipitated beads hinugasan nin limang beses gamit an TNE na igwa nin 0.2% digoxigenin, pig-elute gamit an SDS sample buffer, pinagsuhay sa SDS-PAGE, asin pig-analisar sa paagi nin immunoblotting.
Siring sa ipinapaliwanag sa (31), an pagdeterminar kan cross-linking ginibo sa pinayaman na ER fraction. Sa halipot na panahon, an pinayaman na ER fraction pig-inkubar sa 0.5 mM dithiobis(succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). An reaksyon nin crosslinking pinarong sa paagi nin pagdagdag nin glycine (50 mM huring konsentrasyon, 5 minutos, 20°C).
Siring sa dati nang ipinaliwanag (50), an MS analysis kan ceramide sa wild-type asin GhLag1 strains ginibo. Sa halipot na pagtaram, an mga selula pinadakula sa eksponensyal na yugto (3 sagkod 4 OD600 units/ml) sa YPD sa 30°C, asin 25×107 na mga selula an inani. An saindang metabolismo napaparong gamit an trichloroacetic acid. Gamiton an solvent sa pagkua [ethanol, tubig, ether, pyridine asin 4.2 N ammonium hydroxide (15:15:5:1:0.018 v/v)] asin 1.2 nmol nin internal standard C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid) na kalidad). Gamiton an monomethylamine reagent [methanol, tubig, n-butanol asin methylamine solution (4:3:1:5 v/v)] tanganing maggibo nin maluyang alkaline hydrolysis kan extract, dangan gamiton an water-saturated n-butanol tanganing mag-desalt. Sa katapustapusi, an ekstrakto pigsuspinde giraray sa sarong positibong paagi na solvent [chloroform/methanol/tubig (2:7:1) + 5 mM ammonium acetate] asin pig-ineksion sa mass spectrometer. An multi-reaction monitoring (MRM) ginibo para sa pagmidbid asin pagkwantipika kan mga molekula nin sphingolipid. An TSQ Vantage tertiary quadrupole mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) igwa nin robotic nanoflow ion source Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) para sa pag-analisar kan lipid. An enerhiya nin pagbanggaan na-optimize para sa lambang kategorya nin ceramide. An datos kan MS nakua sa positibong paagi. Para sa lambang biyolohikong replika, an lipid signal iyo an median kan tolong independienteng pagsukol.
Siring sa ipinapaliwanag sa (31), an mga selula (800×107) na nagpapahayag nin Gas1-GFP ipinasairarom sa natural na immunoprecipitation. An pinadalisay na Gas1-GFP pinagsuhay sa paagi nin SDS-PAGE asin ibinalyo sa sarong polyvinylidene fluoride (PVDF) na lamad. An protina nahiling sa paagi nin pagtina kan PVDF na may amide black. An Gas1-GFP band pinutol gikan sa PVDF asin hinugasan nin 5 beses gamit an methanol asin sarong beses gamit an liquid chromatography-MS (LC-MS) grade water. Sa paagi nin pag-inkubar kan membrane strip na may 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), buffer asin 500μl na bagong natunaw na 1 M sodium nitrite mixture sa 37°C sa laog nin 3 oras, an lipid fraction pinaluwas gikan sa Gas1-GFP asin lysed Release of in innophoosine phoosphamise sa pag-ultanan kan ceramiosdeit asin ceramios. (51). Pagkatapos kaiyan, an membrane strip hinugasan nin apat na beses gamit an LC-MS grade water, pinamara sa temperatura kan kwarto, asin itinago sa atmospera nin nitroheno sa -80°C sagkod na ma-analisar. Bilang kontrol, sarong blangko na sample kan PVDF membrane an ginamit para sa lambang eksperimento. An lipid na kinua sa Gas1-GFP dangan inanalisar kan MS siring sa ipinapaliwanag (50). Sa halipot na pagtaram, an mga strip kan PVDF na igwa nin GPI-lipid pig-resuspend sa 75μl na negatibong solvent nin amag [chloroform/methanol (1:2) + 5 mM ammonium acetate] asin nakapasar sa electrospray ionization (ESI)-MRM/MS Analysis of sphingolipid species (TSQ Vantage). Sa kasong ini, an datos kan MS nakua sa negatibong ion mode.
Siring sa nasambit na, an lipid na porsyon kan GPI anchor pinagsuhay sa [3H]-inositol-labeled GPI-AP (16). An mga lipid pinagsuhay sa paagi nin manipis na layer chromatography gamit an sarong sistema nin solvent (55:45:10 chloroform-methanol-0.25% KCl) asin pig-visualize gamit an FLA-7000 (Fujifilm).
An mga selula na nagpapahayag nin Gas1-GFP (600×107) hinugasan nin duwang beses gamit an TNE buffer na may TNE buffer, asin binaak gamit an mga glass beads, dangan pig-centrifuge tanganing mahale an mga ati kan selula asin mga glass beads. An supernatant dangan pig-centrifuge sa 17,000 g sa laog nin 1 oras sa 4°C. An pellet hinugasan sa TNE asin pig-inkubar sa 1 U PI-PLC (Invitrogen) sa TNE na igwa nin 0.2% digitalis saponin sa laog nin 1 oras sa 37°C. Pagkatapos kan pagbolong sa enzyme, an lamad hinale sa paagi nin sentrifugasyon sa 17,000 g sa 4°C sa laog nin 1 oras. Tanganing ma-immunoprecipitate an Gas1-GFP, an supernatant pig-inkubar sa GFP-Trap_A (ChromoTek) sa 4°C sa bilog na banggi. An pinadalisay na Gas1-GFP na pinagsuhay kan SDS-PAGE tinina nin Coomassie brilliant blue. An Gas1-GFP staining band pinutol sa abohon na nakapalibot sa aqueduct, dangan pagkatapos kan alkylation gamit an iodoacetamide asin pagbawas gamit an dithiothreitol, an in-gel digestion gamit an trypsin ginibo. Kuanon asin pamaraon an mga tryptic peptide asin peptide na may GPI-glycans. An pinatuyong peptide tinunaw sa 20 μl nin tubig. Mag-ineksiyon nin sarong porsyon (8μl) sa LC. An octadecylsilane (ODS) na haligi (Develosil 300ODS-HG-5; panlaog na diametro 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japan) ginamit sa pagseparar kan mga peptide sa irarom kan mga espesipikong kondisyon nin gradient. An mobile phase iyo an solvent A (0.08% formic acid) asin solvent B (0.15% formic acid sa 80% acetonitrile). An Accela HPLC system (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) ginamit tanganing i-elute an kolum na may solvent A sa laog nin 55 minutos sa flow rate na 50 μl min-1 sa laog nin 5 minutos, dangan an konsentrasyon kan solvent B piglangkaw sa 40%. , Estados Unidos). An eluate padagos na pig-introdusir sa ESI ion source, asin an mga tryptic peptide asin peptide na may GPI-glycans pig-analisar kan LTQ Orbitrap XL (hybrid linear ion trap-orbitrap mass spectrometer; Thermo Fisher Scientific). Sa MS setup, an boltahe kan capillary source itinalaga sa 4.5 kV, asin an temperatura kan transfer capillary pinagdanay sa 300°C. An boltahe kan kapilarya asin boltahe kan lente kan tubo pigbugtak sa 15 V asin 50 V, sunod-sunod. An datos kan MS nakua sa positibong ion mode (resolusyon na 60,000; pagkaeksakto nin masa na 10 parte kada milyon) sa sarong rango nin masa na 300/m/z mass/charge ratio (m/z) 3000. An datos kan MS/MS nakua sa paagi kan ion trap sa LTQ Orbit [XL) na enot na nakadepende sa mga datos collision induced dissociation (CID)].
An mga simulation kan MD ginibo gamit an GROMACS (52) software asin MARTINI 2 force field (53-55). An CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) dangan ginamit sa paggibo nin sarong bilayer na igwa nin dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) asin Cer C18 o DOPC asin Cer C26. An topolohiya asin mga koordinado kan Cer C26 kinua sa DXCE sa paagi nin paghale kan mga dagdag na kuwintas gikan sa ikog kan sphingosine. Gamiton an proseso na ilinadawan sa ibaba tanganing mabalanse an dobleng layer asin padalaganon ini, dangan gamiton an huring mga koordinado kan sistema tanganing maggibo nin sistema na igwa nin Emp24. An transmembrane domain kan yeast Emp24 (mga residue 173 sagkod 193) pigkonstruhir bilang sarong α-helix gamit an visual MD (VMD) tool molecular structure (58). Dangan, pagkatapos na haleon an mga nag-oorog na lipid, an protina magaspang na granulate asin ilinaog sa bilayer gamit an CHARMM GUI. An huring sistema igwa nin 1202 DOPC asin 302 Cer C26 o 1197 DOPC asin 295 Cer C18 asin Emp24. Ionize an sistema sa konsentrasyon na 0.150M. Apat na independienteng mga replika an ginibo para sa duwang komposisyon na bilayer.
An lipid bilayer pigbabalanse gamit an proseso kan CHARMM GUI, na may kaibang pag-minimize asin dangan pagbalanse nin 405,000 na lakdang, kun saen an mga limitasyon sa posisyon luway-luway na nabawasan asin nahahale, asin an lakdang nin oras pigdadagdagan gikan sa 0.005 ps sagkod 0.02 ps. Pagkatapos kan pagtimbang, ini nagpoprodusir nin 6 μs na may lakdang nin oras na 0.02 ps. Pagkatapos na ibugtak an Emp24, gamiton an parehong proseso kan CHARMM GUI tanganing maibanan asin mabalanse an sistema, dangan magdalagan sa laog nin 8 s sa produksyon.
Para sa gabos na sistema, sa panahon kan proseso nin pagbalanse, an presyon pigkokontrol kan Berendsen barostat (59), asin sa laog kan proseso nin produksyon, an presyon pigkokontrol kan Parrinello-Rahman barostat (60). Sa gabos na kaso, an average na presyon 1 bar asin sarong semi-isotropic pressure coupling scheme an ginagamit. Sa proseso nin pagbalanse asin produksyon, an sarong thermostat (61) na may speed recalibration ginagamit tanganing i-couple an temperatura kan protina, lipid asin mga partikulo nin solvent nin magkasunod. Sa bilog na operasyon, an target na temperatura 310K. An non-bonding interaction kinakalkulo sa paagi nin paggibo nin sarong listahan nin pagpares gamit an Verlet scheme na may 0.005 buffer tolerance. An terminong Coulomb kinakalkulo gamit an larangan nin reaksyon asin sarong distansya nin pagputol na 1.1 nm. An terminong Vander Waals naggagamit nin cut-off scheme na may cut-off na distansya na 1.1 nm, asin an Verlet cut-off scheme ginagamit para sa potensyal na pag-anod (62).
Gamit an VMD, an cutoff wavelength sa pag-ultanan kan DOPC phosphate beads o ceramide AM1 beads asin an protina 0.7 nm, asin an bilang kan mga lipid na nakikipag-interak sa protina kinakalkulo. Susog sa minasunod na pormula, karkulohon an depletion-enrichment (DE) factor arog kan sa (63): DE factor = (an kantidad kan total na lipid sa protina 0.7) sa protina 0.7 (an kantidad kan Cer sa total na lipid)
An ibinareta na halaga nakua bilang sarong average, asin an mga error bar apat na independienteng kopya kan SE. An estadistikal na kahulugan kan DE factor kinakalkulo sa paagi nin t test [(averageDE-factor-1)/SE]. Karkulohon an halaga kan P gikan sa sarong-ikog na distribusyon.
An kasangkapan na GROMACS ginamit sa pagkwenta kan 2D lateral density map kan sistema na igwa nin Emp24 sa laog kan huring 250 ns kan trace. Tanganing makua an mapa nin pagpayaman/pag-ubos kan ceramide, an mapa nin densidad kan Cer binabanga sa suma kan mapa kan Cer asin DOPC, dangan binabanga sa konsentrasyon kan Cer sa hawak. An parehong kolor kan mapa na eskala an ginagamit.
Para sa mga dagdag na materyales para sa artikulong ini, hilingon an http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Ini sarong open access na artikulo na ipinapanao sa irarom kan mga termino kan Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, na nagtutugot kan paggamit, distribusyon asin reproduksyon sa arin man na medium, basta an pinal na paggamit bakong para sa komersyal na ganansya asin an premisa iyo na an orihinal na obra tama. Reperensiya.
Tandaan: Hinahagad mi sana saimo na itao mo an saimong email address tanganing maaraman kan tawong saimong irinerekomendar sa page na gusto mong mahiling ninda an email asin na bako ining spam. Dai kami makakakua nin anuman na mga email address.
An hapot na ini ginagamit tanganing maprobaran kun ika sarong bisita asin maibitaran an awtomatikong pagsusumite nin spam.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lingio Serero, Logazerope (Serhope), (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
An 3D high-resolution real-time imaging nagpapahiling kan importansya kan laba kan kadena nin ceramide para sa pag-sort kan protina sa mga piniling lugar nin output.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lingio Serero, Logazerope (Serhope), (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
An 3D high-resolution real-time imaging nagpapahiling kan importansya kan laba kan kadena nin ceramide para sa pag-sort kan protina sa mga piniling lugar nin output.
©2020 American Association for the Advancement of Science. gabos na deretso reserbado. An AAAS sarong partner kan HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef asin COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.