An mga immunomodulatory metabolites sarong pangenot na tampok kan tumor microenvironment (TME), alagad sa nagkapirang eksepsyon, an saindang mga identidad nagdadanay na dai pa aram. Digdi, inaanalisar niamo an mga tumor asin T cells gikan sa mga tumor asin ascites kan mga pasyente na may high-grade serous carcinoma (HGSC) tanganing ihayag an metabolome kan manlaen-laen na TME compartments na ini. An mga ascites asin mga selula nin tumor igwa nin mahiwas na pagkakaiba sa metabolite. Kun ikukumpara sa ascites, an mga tumor-infiltrating T cells mas mayaman sa 1-methylnicotinamide (MNA). Dawa ngani an lebel kan MNA sa mga selula nin T halangkaw, an ekspresyon kan nicotinamide N-methyltransferase (sarong enzyme na nagtutulod kan pagbalyo kan mga grupo nin methyl gikan sa S-adenosylmethionine pasiring sa nicotinamide) limitado sa mga fibroblast asin mga selula nin tumor. Sa pagpunsyonar, an MNA nag-iinduce sa mga T cells na magluwas kan tumor-promoting cytokine tumor necrosis factor alpha. Kaya, an TME-derived MNA nagkokontribwir sa regulasyon kan immune kan mga T cells asin nagrerepresentar nin sarong potensyal na target nin immunotherapy para sa pagbolong kan kanser sa tawo.
An mga metabolite na hale sa tumor igwa nin hararom na epekto sa pagpugol sa anti-tumor immunity, asin nagdadakol an ebidensya na nagpapahiling na sinda pwede man magserbing pangenot na puwersa para sa pag-uswag kan helang (1). Dugang pa sa epekto kan Warburg, an mga bagong trabaho nagpoon nang mag-karakterisar kan estado nin metabolismo kan mga selula nin tumor asin an relasyon kaini sa estado nin resistensya kan microenvironment kan tumor (TME). An mga pag-aadal sa mga modelo nin daga asin mga T cell nin tawo nagpahiling na an metabolismo kan glutamine (2), metabolismo nin oksidatibo (3) asin metabolismo nin glucose (4) puedeng maghiro nin independiente sa manlaen-laen na subgrupo nin selula nin resistensya. An nagkapirang metabolite sa mga agihan na ini nag-uulang sa anti-tumor na pagpunsyon kan mga selula nin T. Napatunayan na an pagbara kan coenzyme tetrahydrobiopterin (BH4) puedeng makadanyar sa pagdakol kan mga selula nin T, asin an paglangkaw kan BH4 sa hawak puedeng magpaoswag kan anti-tumor immune response na pigpapaagi kan CD4 asin CD8. Dugang pa, an immunosuppressive na epekto kan kynurenine pwedeng iligtas sa paagi kan administrasyon kan BH4 (5). Sa isocitrate dehydrogenase (IDH) mutant glioblastoma, an pagluwas kan enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) nag-uulang sa aktibasyon kan T cell, pagdakol asin Aktibidad nin cytolysis (6). Dai pa sana nahahaloy, ipinaheling na an methylglyoxal, sarong by-product kan glycolysis, nagigibo kan mga suppressor cells na may ginikanan na myeloid, asin an pagbalyo kan T cell kan methylglyoxal puedeng makapugol sa pagpunsyon kan effector T cell. Sa pagbolong, an neutralisasyon kan methylglyoxal puedeng makalampas sa aktibidad kan myeloid-derived suppressor cells (MDSC) asin synergistically na mapakarhay an checkpoint blockade therapy sa mga modelo nin daga (7). An mga pag-aadal na ini kolektibong nagduduon kan pangenot na papel kan mga metabolite na hale sa TME sa pagregulate kan pagpunsyon asin aktibidad kan T cell.
An T cell dysfunction lakop nang ibinareta sa kanser sa obaryo (8). Ini huli sa mga karakteristikong metaboliko na yaon sa hypoxia asin abnormal na vasculature kan tumor (9), na nagreresulta sa pagkombertir kan glucose asin tryptophan sa mga by-product arog kan lactic acid asin kynurenine. An sobrang ekstraselular na lactate minabawas kan produksyon kan interferon-γ (IFN-γ) asin nagtutulod kan pagdibersipika kan mga subgrupo na myelosuppressive (10, 11). An pagkonsumo nin tryptophan direktang nag-uulang sa pagdakol kan T cell asin nag-uulang sa pagsenyas kan receptor kan T cell (12-14). Sa ibong kan mga obserbasyon na ini, kadakol na trabaho na nakapalibot sa metabolismo kan resistensya an ginibo sa in vitro T cell culture gamit an optimized media, o limitado sa mga homologous mouse models in vivo, na mayo man sa mga ini an lubos na nagpapahiling kan heterogeneity kan mga kanser nin tawo asin Physiological macro asin micro environment.
An sarong komun na tampok kan kanser sa obaryo iyo an paglakop kan peritoneal asin an paglataw kan ascites. An pagtipon nin pluwido kan selula sa ascites igwa nin koneksyon sa advanced na helang asin maluyang prognosis (15). Susog sa mga bareta, an pambihirang kompartimentong ini hypoxic, igwa nin halangkaw na lebel nin vascular endothelial growth factor (VEGF) asin indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), asin na-infiltrate kan T regulatory cells asin myeloid inhibitory cells (15-18). An metabolikong kapalibutan kan ascites pwedeng iba sa tumor mismo, kaya an pagprograma giraray kan mga selula nin T sa espasyo kan peritoneal bakong malinaw. Dugang pa, an mga pangenot na pagkakaiba asin pagkakaiba-iba sa pag-ultanan kan mga ascites asin mga metabolite na yaon sa kapalibutan kan tumor pwedeng makaulang sa paglusot kan mga selula nin resistensya asin an saindang pagpunsyon sa mga tumor, asin kaipuhan an dugang pang pagsiyasat.
Tanganing masolusyunan an mga problemang ini, nagdisenyo kami nin sarong sensitibong pagbubulag kan selula asin liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) na paagi tanganing pag-adalan an manlaen-laen na klase nin selula (kaiba an CD4 + asin CD8 + T cells) siring man sa laog asin sa pag-ultanan kan mga tumor An mga metabolite kaini minasakop sa mga selula sa parehong ascites asin tumor na kapalibutan kan pasyente. Ginagamit niamo an paaging ini kaiba an high-dimensional flow cytometry asin single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) tanganing magtao nin sarong halangkaw an resolusyon na retrato kan metabolikong estado kan mga pangenot na populasyon na ini. An paaging ini naghayag nin sarong mahalagang paglangkaw sa lebel kan 1-methylnicotinamide (MNA) sa mga tumor T cells, asin an mga eksperimento sa vitro nagpahiling na an immunomodulatory effect kan MNA sa T cell function dai pa aram kaidto. Sa pankagabsan, an paaging ini nagpapahiling kan magkaparehong metabolikong interaksiyon sa pag-ultanan kan mga tumor asin mga selula nin resistensya, asin nagtatao nin mga pambihirang pananaw sa mga metabolite sa regulasyon kan resistensya, na pwedeng magin kapaki-pakinabang para sa pagbolong kan mga oportunidad sa pagbolong kan immunotherapy kan kanser sa obaryo na nakabase sa T cell.
Naggamit kami nin halangkaw na dimensyon na flow cytometry tanganing sabay na ma-quantify an glucose uptake [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) asin mitochondrial activity [MitoTracker Deep Red (MT DR)) (MT DR, 2017, 2019) yaon sa gilid tipikal na mga marker na nagpapamidbid kan mga selula nin resistensya asin mga populasyon nin selula nin tumor (Table S2 asin Figure S1A). An pag-analisar na ini nagpahiling na kumpara sa mga T cell, an ascites asin tumor cells igwa nin mas halangkaw na lebel nin pag-ako nin glucose, alagad igwa nin mas saradit na pagkakaiba sa aktibidad kan mitochondrial. An average na pag-ako nin glucose kan mga selula nin tumor [CD45-EpCAM (EpCAM)+] tulo sagkod apat na doble kan mga selula nin T, asin an average na pag-ako nin glucose kan mga selula nin CD4 + T 1.2 na doble kan mga selula nin CD8 + T, na nagpapahiling na an mga Tumor infiltrating lymphocytes (TIL) igwa nin manlaen-laen na mga pangangaipo sa metabolismo dawa sa parehong pigura TAME (Figure 1). Sa kabaliktaran, an aktibidad kan mitochondria sa mga selula nin tumor kapareho kan sa mga selula nin CD4 + T, asin an aktibidad kan mitochondria kan parehong klase nin selula mas halangkaw kisa sa mga selula nin CD8 + T (Figure 1B). Sa pangkagabsan, an mga resultang ini nagpapahiling kan lebel kan metabolismo. An metabolikong aktibidad kan mga selula nin tumor mas halangkaw kisa sa mga selula nin CD4 + T, asin an aktibidad nin metabolismo kan mga selula nin CD4 + T mas halangkaw kisa sa mga selula nin CD8 + T. Sa ibong kan mga epektong ini sa mga klase nin selula, mayo nin magkaparehong pagkakaiba sa estado nin metabolismo kan CD4 + asin CD8 + T cells o an saindang relatibong proporsyon sa ascites kumpara sa mga tumor (Figure 1C). Sa kabaliktaran, sa CD45-cell fraction, an proporsyon kan EpCAM+ cells sa tumor naglangkaw kumpara sa ascites (Figure 1D). Naobserbaran man niamo an malinaw na pagkakaiba sa metabolismo sa pag-ultanan kan mga sangkap kan EpCAM+ asin EpCAM- cell. An mga selula nin EpCAM+ (tumor) igwa nin mas halangkaw na pag-ako nin glucose asin aktibidad kan mitochondria kisa sa mga selula nin EpCAM-, na mas halangkaw nanggad kisa sa metabolikong aktibidad kan mga fibroblast sa mga selula nin tumor sa TME (Figure 1, E asin F).
(A asin B) Median fluorescence intensity (MFI) kan glucose uptake (2-NBDG) (A) asin mitochondrial activity kan CD4 + T cells (MitoTracker maitom na pula) (B) Representatibong mga graph (wala) asin tabulated data (Tuo), CD8 + T cells asin EpCAM + CD45-tumor cells asin mga tumor bilang tumor. (C) An ratio kan CD4 + asin CD8 + na mga selula (kan CD3 + T na mga selula) sa ascites asin tumor. (D) Proporsyon kan EpCAM + tumor cells sa ascites asin tumor (CD45−). (E asin F) EpCAM + CD45-tumor asin EpCAM-CD45-matrix glucose uptake (2-NBDG) (E) asin mitochondrial activity (MitoTracker maitom na pula) (F) mga representanteng graph (wala) asin tabulated data (Tuo) Ascites asin mga selula nin tumor. (G) Mga representanteng graph kan CD25, CD137 asin PD1 na ekspresyon sa paagi nin flow cytometry. (H asin I) CD25, CD137 asin PD1 na ekspresyon sa CD4 + T cells (H) asin CD8 + T cells (I). (J asin K) Naive, central memory (Tcm), effector (Teff) asin effector memory (Tem) na mga phenotype base sa ekspresyon kan CCR7 asin CD45RO. Mga representanteng imahe (wala) asin tabular na datos (tuo) kan CD4 + T cells (J) asin CD8 + T cells (K) sa ascites asin tumor. An mga halaga kan P na nadeterminaran sa paagi nin ipinares na t-test (*P<0.05, **P<0.01 asin ***P<0.001). An linya nagrerepresentar kan mga pasyenteng magkapareho (n = 6). FMO, fluorescence minus one; MFI, median na intensidad kan fluorescence.
An dugang pang pag-analisar naghayag nin iba pang mga makahulogan na pagkakaiba sa pag-oltanan kan halangkaw na naresolberan na estado nin phenotypic kan T cell. An na-aktibo (Figure 1, G sagkod I) asin effector memory (Figure 1, J asin K) sa mga tumor mas parati kisa sa ascites (proporsyon kan CD3 + T cells). Siring man, an pag-analisar kan phenotype sa paagi kan ekspresyon kan mga marker nin aktibasyon (CD25 asin CD137) asin mga marker nin pag-ubos [programmed cell death protein 1 (PD1)] nagpahiling na dawa ngani an mga karakteristiko sa metabolismo kan mga populasyon na ini magkaiba (Figure S1, B sagkod E), Alagad mayo nin mga makahulogan na pagkakaiba sa metabolismo an padagos na naobserbaran sa pag-oltanan kan mga naive, o subset na epekto sa memorya (Figure S1, F1 AKO). An mga resultang ini nakumpirma sa paagi kan paggamit nin mga paagi nin pag-adal nin makina tanganing awtomatikong mag-asignar nin mga phenotype nin selula (21), na orog pang nagbuyagyag kan presensya nin dakulang bilang nin mga selula nin utak kan tulang (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) sa ascites kan pasyente (Figure S2A ). Sa gabos na namidbid na klase nin selula, an populasyon na ini nin myeloid cell nagpahiling kan pinakahalangkaw na pag-ako nin glucose asin aktibidad kan mitochondria (Figure S2, B sagkod G). An mga resultang ini nagpapahiling kan makusog na pagkakaiba sa metabolismo sa pag-ultanan kan manlaen-laen na klase nin selula na makukua sa mga ascites asin tumor sa mga pasyenteng HGSC.
An mayor na angat sa pagsabot kan mga karakteristiko kan metabolismo kan TIL iyo an pangangaipo na mag-isolate nin mga sample nin T cell na may supisyenteng kadalisayan, kalidad asin kantidad gikan sa mga tumor. An mga bagong pag-aadal nagpahiling na an mga paagi nin pag-sort asin pagpayaman nin bead base sa flow cytometry pwedeng magresulta sa mga pagbabago sa mga profile kan metabolite kan selula (22-24). Tanganing malampasan an problemang ini, pig-optimize niamo an paagi nin pagpayaman kan bead tanganing i-isolate asin i-isolate an TIL gikan sa surgical resected human ovarian cancer bago an pag-analisar sa paagi nin LC-MS/MS (hilingon an mga Materyales asin Paagi; Pigura 2A). Tanganing ma-assess an kabilogan na epekto kan protocol na ini sa mga pagbabago sa metabolite, pigkumpara niamo an mga profile kan metabolite kan mga T cells na pig-aktibo kan mga marahay na donor pagkatapos kan nasa itaas na lakdang nin pagbubulag kan mga kuwintas sa mga selula na dai nabubulag nin mga kuwintas alagad nagdanay sa yelo. An pag-analisar na ini sa pagkontrol kan kalidad nadiskubre na igwa nin halangkaw na korelasyon sa pag-ultanan kan duwang kondisyon na ini (r = 0.77), asin an teknikal na pag-otro kan grupo nin 86 na mga metabolite igwa nin halangkaw na pag-otro (Figure 2B). Kaya, an mga paaging ini makakagibo nin eksaktong pag-analisar kan metabolite sa mga selula na nag-aagi nin pagpayaman kan klase nin selula, kaya nagtatao kan enot na halangkaw an resolusyon na plataporma para sa pagmidbid nin mga espesipikong metabolite sa HGSC, sa siring nagpapangyari sa mga tawo na magkaigwa nin mas hararom na pakasabot sa espesipiko kan selula Sexual metabolism program.
(A) Eskematikong diagram kan pagpayaman kan magnetic bead. Bago an pag-analisar sa paagi nin LC-MS/MS, an mga selula maagi nin tolong magkasunod na paglibot nin magnetic bead enrichment o magdadanay sa yelo. (B) An epekto kan klase nin pagpayaman sa kadakolan kan mga metabolite. An average kan tolong pagsukol para sa lambang klase nin pagpayaman ± SE. An abohon na linya nagrerepresentar nin 1:1 na relasyon. An intra-class correlation (ICC) kan mga paorootrong pagsukol na ipinapahiling sa axis label. NAD, nicotinamide adenine dinucleotide. (C) Eskematikong diagram kan dalagan kan trabaho kan pag-analisar kan metabolite kan pasyente. An mga ascite o tumor kinukua sa mga pasyente asin pig-cryopreserve. An sadit na porsyon kan lambang sample pig-analisar sa paagi nin flow cytometry, mantang an natatadang mga sample nag-agi nin tolong round nin pagpayaman para sa CD4+, CD8+ asin CD45- na mga selula. An mga fraction na ini nin selula pinag-analisar gamit an LC-MS/MS. (D) Mapa nin init kan standardized na kadakolan kan metabolite. An dendrogram nagrerepresentar kan paggrupo ni Ward kan mga distansya kan Euclidean sa pag-ultanan kan mga sampol. (E) Principal component analysis (PCA) kan sample metabolite map, na nagpapahiling nin tolong replika kan lambang sample, an mga sample gikan sa parehong pasyente konektado sa paagi nin sarong linya. (F) An PCA kan metabolite profile kan sample na pigkondisyon sa pasyente (ie, gamit an parsial na redundancy); an klase nin sample limitado kan convex hull. PC1, mayor na sangkap 1; PC2, mayor na sangkap 2.
Sunod, pig-aplikar niamo an paaging ini nin pagpayaman tanganing analisaron an 99 na mga metabolite sa CD4 +, CD8 + asin CD45-cell fractions sa mga primaryang ascites asin tumor kan anom na pasyenteng HGSC (Figure 2C, Figure S3A asin Table S3 asin S4). An populasyon na interesado minaabot sa 2% sagkod 70% kan orihinal na dakulang sampol nin mga buhay na selula, asin an proporsyon kan mga selula nagkakaiba-iba sa pag-oltanan kan mga pasyente. Pagkatapos na iseparar an mga kuwintas, an pinayaman na fraction kan interes (CD4+, CD8+ o CD45-) nag-aako nin sobra sa 85% kan gabos na buhay na selula sa sample sa promedyo. An paaging ini nin pagpayaman nagtutugot sato na analisaron an mga populasyon nin selula gikan sa metabolismo kan tisyu nin tumor nin tawo, na imposibleng gibohon gikan sa darakulang sampol. Gamit an protocol na ini, nadeterminaran niamo na an l-kynurenine asin adenosine, an duwang marhay na karakterisadong immunosuppressive metabolites na ini nalangkaw sa mga tumor T cells o tumor cells (Figure S3, B asin C). Kaya, an mga resultang ini nagpapahiling kan kaimbodan asin kakayahan kan samong pagbubulag kan selula asin teknolohiya nin mass spectrometry tanganing makahanap nin mga metabolite na importante sa biolohiya sa mga tisyu kan pasyente.
An samong pag-analisar naghayag man nin sarong makusog na metabolikong pagbubulag kan mga klase nin selula sa laog asin sa pag-ultanan kan mga pasyente (Figure 2D asin Figure S4A). Sa partikular, kumpara sa ibang mga pasyente, an pasyente 70 nagpahiling nin manlaen-laen na metabolikong karakteristiko (Figure 2E asin Figure S4B), na nagpapahiling na pwedeng igwa nin substansyal na metabolikong heterogeneity sa pag-ultanan kan mga pasyente. Mahalagang mangnohon na kumpara sa ibang mga pasyente (1.2 sagkod 2 litro; Table S1), an total na kantidad kan ascites na nakolekta sa pasyente 70 (80 ml) mas sadit. An pagkontrol kan inter-patient heterogeneity sa panahon kan pag-analisar kan prinsipal na sangkap (halimbawa, gamit an parsyal na pag-analisar kan redundancy) nagpapahiling nin mga pagbabago sa pag-oltanan kan mga klase nin selula, asin an mga klase nin selula asin/o microenvironment malinaw na pinagsararo susog sa profile kan metabolite (Figure 2F ). An pag-analisar kan mga solong metabolite nagduon kan mga epektong ini asin naghayag nin mga mahalagang pagkakaiba sa pag-ultanan kan mga klase nin selula asin microenvironment. Mahalagang mangnohon na an pinakagrabeng pagkakaiba na naobserbaran iyo an MNA, na parati na pinayaman sa CD45- cells asin sa CD4+ asin CD8+ cells na nag-iinfiltrate sa tumor (Figure 3A). Para sa mga selula nin CD4 +, an epektong ini pinakamalinaw, asin an MNA sa mga selula nin CD8 + garo baga makusog man na apektado kan kapalibutan. Alagad, bako ining mahalaga, huli ta tolo sana sa anom na pasyente an pwedeng ma-ebalwar para sa mga marka kan tumor CD8+. Dugang pa sa MNA, sa manlaen-laen na klase nin mga selula sa ascites asin mga tumor, an ibang mga metabolite na maluyang na-karakterisa sa TIL igwa man nin pagkakaiba-iba na mayaman (Mga Pigura S3 asin S4). Kaya, an mga datos na ini nagpapahiling nin sarong promising set nin mga immunomodulatory metabolites para sa dugang pang pagsiyasat.
(A) Normalisadong laog kan MNA sa CD4+, CD8+ asin CD45- na mga selula gikan sa ascites asin tumor. An box plot nagpapahiling kan median (linya), interquartile range (frame hinge) asin data range, sagkod sa 1.5 na beses kan interquartile range (frame whisker). Siring sa ipinapaliwanag sa Patient Materials and Methods, gamiton an limma value kan pasyente tanganing madeterminaran an P value (*P<0.05 asin **P<0.01). (B) Eskematikong diagram kan metabolismo kan MNA (60). Mga Metabolito: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl- 2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, nicotinamide mononucleotide. Mga enzyme (berde): NNMT, nicotinamide N-methyltransferase; SIRT, mga sirtuins; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyl transferase; AOX1, aldehyde oxidase 1; NRK, nicotinamide riboside kinase; NMNAT, nicotinamide mono Nucleotide adenylate transferase; Pnp1, purine nucleoside phosphorylase. (C) t-SNE kan scRNA-seq kan ascites (abo) asin tumor (pula; n = 3 pasyente). (D) Ekspresyon kan NNMT sa manlaen-laen na populasyon nin selula na namidbid gamit an scRNA-seq. (E) Ekspresyon kan NNMT asin AOX1 sa SK-OV-3, human embryonic kidney (HEK) 293T, T cells asin MNA-treated T cells. An nakatiklop na ekspresyon ipinapahiling relatibo sa SK-OV-3. An pattern nin ekspresyon na may SEM ipinapahiling (n = 6 na mga marahay na donor). An mga halaga nin Ct na mas halangkaw sa 35 pigkokonsiderar na dai nahihiling (UD). (F) Ekspresyon kan SLC22A1 asin SLC22A2 sa SK-OV-3, HEK293T, T cells asin T cells na tinawan nin 8mM MNA. An nakatiklop na ekspresyon ipinapahiling relatibo sa SK-OV-3. An pattern nin ekspresyon na may SEM ipinapahiling (n = 6 na mga marahay na donor). An mga halaga nin Ct na mas halangkaw sa 35 pigkokonsiderar na dai nahihiling (UD). (G) An laog kan MNA kan selula sa mga aktibong marahay na donor T cells pagkatapos nin 72 oras nin pag-inkubar sa MNA. An pattern nin ekspresyon na may SEM ipinapahiling (n = 4 na mga marahay na donor).
An MNA nagigibo sa paagi nin pagbalyo kan grupong methyl gikan sa S-adenosyl-1-methionine (SAM) pasiring sa nicotinamide (NA) sa paagi kan nicotinamide N-methyltransferase (NNMT; Pigura 3B). An NNMT sobrang ipinapahayag sa manlaen-laen na kanser sa tawo asin ini may koneksyon sa pagdakol, pagsalakay asin metastasis (25-27). Tanganing mas masabutan an pinagkukuanan kan MNA sa mga selula nin T sa TME, ginamit niamo an scRNA-seq tanganing ma-karakterisa an ekspresyon kan NNMT sa mga klase nin selula sa mga ascites asin tumor kan tolong pasyenteng HGSC (Table S5). An pag-analisar kan mga 6,500 na selula nagpahiling na sa mga kapalibutan nin ascites asin tumor, an ekspresyon kan NNMT limitado sa pigtutubodan na populasyon nin fibroblast asin selula nin tumor (Figure 3, C asin D). Mahalagang mangnohon na mayo nin malinaw na ekspresyon kan NNMT sa arin man na populasyon na nagpapahayag nin PTPRC (CD45 +) (Figure 3D asin Figure S5A), na nagpapahiling na an MNA na nadetektar sa spectrum nin metabolite ipinamidbid na sa mga selula nin T. An ekspresyon kan aldehyde oxidase 1 (AOX1) nagkokombertir kan MNA sa 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) o 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide (4- PYR); An Figure 3B) limitado man sa populasyon kan mga fibroblast na nagpapahayag nin COL1A1 (Figure S5A), na magkasararo na nagpapahiling na an mga T cells kulang sa kakayahan kan kombensyonal na metabolismo kan MNA. An pattern nin ekspresyon kan mga gene na ini na may relasyon sa MNA na-verify gamit an ikaduwang independienteng set nin datos kan selula gikan sa ascites gikan sa mga pasyenteng HGSC (Figure S5B; n = 6) (16). Dugang pa, an quantitative polymerase chain reaction (qPCR) na pag-analisar kan mga marahay na donor T cells na tinawan nin MNA nagpahiling na kumpara sa kontrol SK-OV-3 ovarian tumor cells, an NNMT o AOX1 haros dai naipahayag (Figure 3E). An mga dai linalaoman na resultang ini nagpapahiling na an MNA pwedeng iluwas gikan sa mga fibroblast o tumor pasiring sa mga kataid na T cells sa TME.
Dawa ngani an mga kandidato kabali an pamilya kan mga organikong cation transporter 1 sagkod 3 (OCT1, OCT2 asin OCT3) na naka-encode kan soluble carrier 22 (SLC22) na pamilya (SLC22A1, SLC22A2 asin SLC22A3), an mga potensyal na transporter kan MNA dai pa nadedepinir (28) . An QPCR kan mRNA gikan sa mga marahay na donor T cells nagpahiling nin hababang lebel nin ekspresyon kan SLC22A1 alagad dai nahihiling na lebel kan SLC22A2, na nagkumpirma na ini dati nang naireport sa literatura (Figure 3F) (29). Sa kabaliktaran, an SK-OV-3 ovarian tumor cell line nagpapahayag nin halangkaw na lebel kan parehong mga transporter (Figure 3F).
Tanganing ma-test an posibilidad na an mga T cells igwa nin kakayahan na magsupsop nin dayuhan na MNA, an mga marahay na donor T cells pigkultibar sa laog nin 72 oras sa presensya nin manlaen-laen na konsentrasyon nin MNA. Sa kawaran nin exogenous MNA, an laog kan selula kan MNA dai mahihiling (Figure 3G). Alagad, an mga aktibong T cells na tinawan nin exogenous MNA nagpahiling nin sarong dose-dependent na paglangkaw sa laog kan MNA sa mga selula, sagkod sa 6 mM MNA (Figure 3G). An resultang ini nagpapahiling na sa ibong kan hababang lebel kan ekspresyon kan transporter asin kawaran kan mayor na enzyme na responsable sa metabolismo kan intracellular MNA, an TIL pwede pa man giraray na magkua nin MNA.
An spectrum kan mga metabolite sa mga T cell kan mga pasyente asin an mga eksperimento sa pag-absorb kan MNA sa vitro nagpapadakula kan posibilidad na an mga fibroblast na may relasyon sa kanser (CAF) nagbubuga nin MNA asin an mga selula nin tumor puedeng magregulate kan phenotype asin pagpunsyon kan TIL. Tanganing madeterminaran an epekto kan MNA sa mga T cells, an mga marahay na donor T cells pig-aktibo sa vitro sa presensya o kawaran nin MNA, asin an saindang pagdakol asin produksyon nin cytokine pig-ebalwar. Pakalihis nin 7 aldaw na pagdagdag nin MNA sa pinakahalangkaw na dosis, an bilang kan pagdoble kan populasyon katamtaman na nabawasan, mantang an kusog napagdanay sa gabos na dosis (Figure 4A). Dugang pa, an pagbolong kan exogenous MNA nagresulta sa paglangkaw kan proporsyon kan CD4 + asin CD8 + T cells na nagpapahayag nin tumor necrosis factor-α (TNFα; Figure 4B). Sa kabaliktaran, an intracellular na produksyon kan IFN-γ nagin signipikanteng nabawasan sa CD4 + T cells, alagad bako sa CD8 + T cells, asin mayo nin signipikanteng pagbabago sa interleukin 2 (IL-2; Pigura 4, C asin D). Kaya, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kan mga supernatant gikan sa mga kulturang T cell na tinawan nin MNA nagpahiling nin sarong signipikanteng paglangkaw sa TNFα, sarong pagbaba sa IFN-γ, asin mayong pagbabago sa IL-2 (Figure 4, E sagkod G). . An pagbaba kan IFN-γ nagpapahiling na an MNA pwedeng magkaigwa nin papel sa pagpugol kan anti-tumor na aktibidad kan mga selula nin T. Tanganing ma-simulate an epekto kan MNA sa T cell-mediated cytotoxicity, an mga chimeric antigen receptor T (FRα-CAR-T) na mga selula na nagtatarget sa folate receptor α asin CAR-T (GFP) na pigreregular kan green fluorescent protein (GFP) -CAR-T) na mga selula piggigibo kan mga marahay na donor peripheral blood mononuclear cells (PBMC). An mga selula nin CAR-T pigkultibar sa laog nin 24 oras sa presensya kan MNA, dangan pigkultibar kaiba an mga selula nin tumor sa obaryo kan tawo na SK-OV-3 na nagpapahayag kan folate receptor α sa sarong effector to target ratio na 10:1. An pagbolong sa MNA nagresulta sa sarong mahalagang pagbaba sa aktibidad nin paggadan kan mga selula nin FRα-CAR-T, na kapareho kan mga selula nin FRα-CAR-T na tinawan nin adenosine (Figure 4H).
(A) Total na bilang nin viable cell asin pagdoble kan populasyon (PD) direkta gikan sa kultura sa aldaw 7. An bar graph nagrerepresentar kan mean + SEM kan anom na marahay na mga donor. Nagrerepresentar nin datos gikan sa dai mababa sa n = 3 independienteng eksperimento. (B sagkod D) An CD3/CD28 asin IL-2 ginamit tanganing ma-aktibo an mga T cells sa saindang kanya-kanyang konsentrasyon nin MNA sa laog nin 7 aldaw. Bago an pag-analisar, an mga selula pig-stimulate nin PMA/ionomycin na may GolgiStop sa laog nin 4 na oras. TNFα (B) na ekspresyon sa mga selula nin T. Halimbawang imahe (wala) asin tabular na datos (tuo) kan ekspresyon kan TNFα sa mga buhay na selula. IFN-γ (C) asin IL-2 (D) na ekspresyon sa mga selula nin T. An ekspresyon kan mga cytokine sinusukol sa paagi nin flow cytometry. An bar graph nagrerepresentar kan mean (n = 6 na mga marahay na donor) + SEM. Gamiton an one-way analysis of variance asin mga paorootrong lakdang (*P<0.05 asin **P<0.01) tanganing madeterminaran an P value. Nagrerepresentar nin datos gikan sa dai mababa sa n = 3 independienteng eksperimento. (E sagkod G) An CD3/CD28 asin IL-2 ginamit tanganing ma-aktibo an mga T cells sa saindang kanya-kanyang konsentrasyon nin MNA sa laog nin 7 aldaw. An medium nakolekta bago asin pagkatapos kan 4 na oras nin PMA/ionomycin stimulation. An mga konsentrasyon kan TNFα (E), IFN-γ (F) asin IL-2 (G) sinusukol sa paagi nin ELISA. An bar graph nagrerepresentar kan mean (n = 5 na mga marahay na donor) + SEM. An halaga kan P nadeterminaran gamit an one-way analysis of variance asin paorootrong mga pagsukol (*P<0.05). An tuldok na linya nagpapahiling kan limitasyon kan pagdetektar kan pagdetektar. (H) Pag-analisar nin pag-utod kan selula. An mga selula kan FRα-CAR-T o GFP-CAR-T pig-adjust gamit an adenosine (250μM) o MNA (10 mM) sa laog nin 24 oras, o pinabayaan na dai tinatrato (Ctrl). An porsyento nin paggadan kan mga selula nin SK-OV-3 sinusukol. An halaga kan P na nadeterminaran kan Welch t test (*P<0.5 asin **P<0.01).
Tanganing magkaigwa nin mekanistikong pakasabot sa MNA-dependent TNFα expression regulation, an mga pagbabago sa TNFα mRNA kan MNA-treated T cells pig-ebalwar (Figure 5A). An mga marahay na donor T cells na tinawan nin MNA nagpahiling nin duwang dobleng paglangkaw sa lebel nin transkripsyon kan TNFα, na nagpapahiling na an MNA nakadepende sa regulasyon kan transkripsyon kan TNFα. Tanganing maimbestigaran an posibleng mekanismo nin regulasyon na ini, duwang midbid na mga transcription factor na nagreregular kan TNFα, arin na baga an activated T cell nuclear factor (NFAT) asin specific protein 1 (Sp1), an pig-ebalwar bilang simbag sa pagbugkos kan MNA sa proximal TNFα promoter ( 30). An TNFα promoter igwa nin 6 na namidbid na mga lugar nin pagbugkos kan NFAT asin 2 na mga lugar nin pagbugkos kan Sp1, na nag-oorogpa sa sarong lugar [-55 base pairs (bp) gikan sa 5'cap] (30). An Chromatin immunoprecipitation (ChIP) nagpahiling na kun tinatrato nin MNA, an pagbugkos kan Sp1 sa TNFα promoter naglangkaw nin tolong doble. An paglaog kan NFAT naglangkaw man asin nagrani sa importansya (Figure 5B). An mga datos na ini nagpapahiling na an MNA nagreregular kan ekspresyon kan TNFα sa paagi kan transkripsyon kan Sp1, asin sa mas dikit na paagi an ekspresyon kan NFAT.
(A) Kun ikukumpara sa mga selula nin T na pigkultibar na mayong MNA, an pagbabago kan TNFα na ekspresyon sa mga selula nin T na tinawan nin MNA. An pattern nin ekspresyon na may SEM ipinapahiling (n = 5 na mga marahay na donor). Nagrerepresentar nin datos gikan sa dai mababa sa n = 3 independienteng eksperimento. (B) An TNFα promoter kan mga T cells na tinatrato na may o mayong 8 mM MNA pagkatapos kan NFAT asin Sp1 pinagsararo sa (Ctrl) asin PMA/ionomycin stimulation sa laog nin 4 na oras. An Immunoglobulin G (IgG) asin H3 ginamit bilang negatibo asin positibong kontrol para sa immunoprecipitation, sunod-sunod. An pagkwantipika kan ChIP nagpahiling na an pagbugkos kan Sp1 asin NFAT sa TNFα promoter sa mga selula na tinawan nin MNA naglangkaw nin nagkapirang beses kumpara sa kontrol. Nagrerepresentar nin datos gikan sa dai mababa sa n = 3 na independienteng eksperimento. P na halaga na nadeterminaran sa paagi nin dakol na t-test (*** P <0.01). (C) Kun ikukumpara sa ascites kan HGSC, an mga T cells (bakong cytotoxic) nagpahiling nin mas halangkaw na ekspresyon kan TNF sa tumor. An mga kolor nagrerepresentar nin manlaen-laen na pasyente. An mga ipinapahiling na mga selula random na pig-sample sa 300 asin pig-jitter tanganing limitaran an overdrawing (** Padj = 0.0076). (D) Ipinupuntong modelo kan MNA para sa kanser sa obaryo. An MNA nagigibo sa mga selula nin tumor asin mga fibroblast sa TME asin kinukua kan mga selula nin T. An MNA nagpapadakol kan pagbugkos kan Sp1 sa TNFα promoter, na nagbubunga nin paglangkaw kan transkripsyon kan TNFα asin produksyon nin TNFα cytokine. An MNA nagigin dahelan man nin pagbaba kan IFN-γ. An pagpugol sa pagpunsyon kan T cell nagbubunga nin nabawasan na kakayahan sa paggadan asin pinarikas na pagtalubo kan tumor.
Susog sa mga bareta, an TNFα igwa nin mga epekto sa atubangan asin likod na nakadepende sa anti-tumor asin anti-tumor, alagad igwa ining midbid na papel sa pagpapauswag kan pagtalubo asin metastasis kan kanser sa obaryo (31-33). Susog sa mga bareta, an konsentrasyon kan TNFα sa ascites asin mga tisyu nin tumor sa mga pasyenteng may kanser sa obaryo mas halangkaw kisa sa mga tisyu na benign (34-36). Sa mga termino nin mekanismo, an TNFα pwedeng magregulate kan aktibasyon, pagpunsyon asin pagdakol kan mga puting selula nin dugo, asin mabago an phenotype kan mga selula nin kanser (37, 38). Susog sa mga nadiskubre na ini, an pag-analisar kan ekspresyon kan gene na may pagkakaiba nagpahiling na an TNF signipikanteng na-up-regulate sa mga T cells sa mga tisyu nin tumor kumpara sa ascites (Figure 5C). An paglangkaw kan ekspresyon kan TNF nahihiling sana sa mga populasyon nin T cell na may non-cytotoxic phenotype (Figure S5A). Sa sumaryo, an mga datos na ini nagsusuporta sa punto de vista na an MNA igwa nin duwang immunosuppressive asin tumor promoting effects sa HGSC.
An fluorescent labeling base sa flow cytometry iyo an nagin mayor na paagi para sa pag-adal kan metabolismo kan TIL. An mga pag-aadal na ini nagpahiling na kumpara sa mga peripheral blood lymphocytes o T cells gikan sa mga segundaryong lymphoid organ, an murine asin human TIL igwa nin mas halangkaw na tendensiyang mag-uptake nin glucose (4, 39) asin an luway-luway na pagkawara kan mitochondrial function (19, 40). Dawa ngani naobserbaran niamo an kaparehong mga resulta sa pag-aadal na ini, an pangenot na pag-uswag iyo an pagkumpara kan metabolismo kan mga selula nin tumor asin TIL gikan sa parehong pinutol na tisyu nin tumor. Susog sa nagkapira sa mga nakaaging report na ini, an mga tumor (CD45-EpCAM +) na mga selula gikan sa ascites asin mga tumor igwa nin mas halangkaw na pag-ako nin glucose kisa sa CD8 + asin CD4 + T cells, na nagsusuportar na an halangkaw na pag-ako nin glucose kan mga selula nin tumor pwedeng ikumpara sa mga T cells. An konsepto kan kompetisyon kan T cell. TME. Alagad, an aktibidad kan mitochondria kan mga selula nin tumor mas halangkaw kisa sa mga selula nin CD8 + T, alagad an aktibidad kan mitochondria kapareho kan mga selula nin CD4 + T. An mga resultang ini nagpapakusog kan nagtutubong tema na an oxidative metabolism importante para sa mga selula nin tumor (41, 42). Isinusuherir man ninda na an CD8 + T cells pwedeng mas madaling mabiktima nin oxidative dysfunction kisa CD4 + T cells, o na an CD4 + T cells pwedeng maggamit nin mga pinagkukuanan nin karbon na iba sa glucose tanganing mamantenir an aktibidad kan mitochondrial (43, 44). Dapat na mangnohon na mayo kaming naobserbaran na pagkakaiba sa pag-ako nin glucose o aktibidad kan mitochondrial sa pag-ultanan kan CD4 + T effectors, T effector memory asin T central memory cells sa ascites. Siring man, an estado nin pagdibersipika kan CD8 + T cells sa mga tumor mayo nin koneksyon sa mga pagbabago sa pag-ako nin glucose, na nagpapahiling kan mahalagang pagkakaiba sa pag-ultanan kan mga T cells na pigkultibar sa vitro asin human TIL sa vivo (22). An mga obserbasyon na ini nakumpirma man sa paagi kan paggamit nin daing kinakampihan na awtomatikong alokasyon kan populasyon nin selula, na orog pang nagbuyagyag na an CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + na mga selula na may mas halangkaw na pag-ako nin glucose asin aktibidad kan mitochondrial kisa mga selula nin tumor lakop alagad igwa nin aktibong populasyon nin selula sa Metabolic. An populasyon na ini pwedeng magrepresentar kan putatibong subpopulasyon kan mga myeloid suppressor cells o plasmacytoid dendritic cells na namidbid sa scRNA-seq analysis. Dawa ngani pareho ining naireport sa mga tumor sa obaryo nin tawo [45], kaipuhan pa man giraray ninda An dugang pang trabaho iyo an paglaladawan kan myeloid subpopulation na ini.
Dawa ngani an mga paagi na nakabase sa flow cytometry puedeng maglinaw kan mga pankagabsan na pagkakaiba sa glucose asin oxidative metabolism sa pag-oltanan kan mga klase nin selula, an eksaktong mga metabolite na nagigibo kan glucose o iba pang mga pinagkukuanan nin karbon para sa metabolismo kan mitochondrial sa TME dai pa nadeterminaran. An pag-asignar kan presensya o kawaran nin mga metabolite sa sarong itinaong TIL subset nangangaipo nin paglinig kan populasyon kan selula gikan sa pinutol na tisyu. Kaya, an samong paagi nin pagpayaman nin selula na pinagsararo sa mass spectrometry makakatao nin mga pananaw sa mga metabolite na magkakalaen na pinayaman sa mga populasyon nin T cells asin tumor cell sa mga magkaparehong sample nin pasyente. Dawa ngani an paaging ini igwa nin mga bentaha sa fluorescence-activated cell sorting, an nagkapirang mga libreriya nin metabolite pwedeng maapektaran huli sa inherent stability asin/o marikas na turnover rate (22). Dawa siring, an samong paagi nakapagmidbid nin duwang midbid na immunosuppressive metabolites, an adenosine asin kynurenine, huli ta sinda magkakalaen na gayo sa pag-oltanan kan mga klase nin sample.
An samong metabolomic analysis kan mga tumor asin TIL subtypes nagtatao nin mas dakol na pananaw sa papel kan mga metabolite sa ovarian TME. Enot, gamit an flow cytometry, nadeterminaran niamo na mayo nin pagkakaiba sa aktibidad kan mitochondrial sa pag-ultanan kan mga tumor asin CD4 + T cells. Alagad, an pag-analisar kan LC-MS/MS naghayag nin mga mahalagang pagbabago sa kadakolan kan mga metabolite sa mga populasyon na ini, na nagpapahiling na an mga konklusyon manungod sa metabolismo kan TIL asin an kabilogan na aktibidad kaini sa metabolismo nangangaipo nin maingat na interpretasyon. Ikaduwa, an MNA iyo an metabolite na may pinakadakulang pagkakaiba sa pag-ultanan kan CD45-cells asin T cells sa ascites, bako sa mga tumor. Kaya, an kompartimentalisasyon asin lokasyon kan tumor pwedeng magkaigwa nin manlaen-laen na epekto sa metabolismo kan TIL, na nagpapahiling kan posibleng pagkakaiba-iba sa sarong tinaong mikro-kapalibutan. Ikatolo, an ekspresyon kan enzyme na nagpoprodusir nin MNA na NNMT limitado sa CAF, na iyo an mga selula nin tumor sa mas dikit na paagi, alagad an mga lebel nin MNA na nahihiling sa mga selula nin T na hale sa tumor. An sobrang ekspresyon kan NNMT sa ovarian CAF igwa nin midbid na epekto sa pagpapauswag kan kanser, na parte huli sa pagpapauswag kan metabolismo kan CAF, pagsalakay kan tumor asin metastasis (27). Dawa ngani an kabilogan na lebel kan TIL katamtaman, an ekspresyon kan NNMT sa CAF harani sa Cancer Genome Atlas (TCGA) mesenchymal subtype, na may koneksyon sa maluyang prognosis (27, 46, 47). Sa katapustapusi, an ekspresyon kan enzyme AOX1 na responsable sa pagkaraot kan MNA limitado man sa populasyon kan CAF, na nagpapahiling na an mga selula nin T kulang sa kakayahan na mag-metabolize kan MNA. An mga resultang ini nagsusuporta sa ideya na dawa ngani kaipuhan an dugang pang trabaho tanganing ma-verify an nakuang ini, an halangkaw na lebel nin MNA sa mga T cells pwedeng magpahiling kan presensya nin sarong immunosuppressive CAF microenvironment.
Huli sa hababang lebel nin ekspresyon kan mga transporter nin MNA asin an dai nahihiling na lebel kan mga pangenot na protina na imbuelto sa metabolismo kan MNA, an presensya kan MNA sa mga selula nin T dai linalaoman. Ni an NNMT ni an AOX1 dai nadetektaran sa paagi nin pag-analisar kan scRNA-seq asin target na qPCR kan duwang independienteng grupo. An mga resultang ini nagpapahiling na an MNA dai piggigibo kan mga T cell, kundi nasusupsop gikan sa nakapalibot na TME. An mga eksperimento sa vitro nagpapahiling na an mga T cells may tendensiyang magtipon nin exogenous MNA.
An samong mga pag-aadal sa vitro nagpahiling na an exogenous MNA nag-iinduce kan ekspresyon kan TNFα sa T cells asin nagpapauswag kan pagbugkos kan Sp1 sa TNFα promoter. Dawa ngani an TNFα igwa nin parehong anti-tumor asin anti-tumor na mga function, sa kanser sa obaryo, an TNFα puedeng magpalakop kan pagtalubo kan kanser sa obaryo (31-33). An pag-neutralize kan TNFα sa kultura kan selula nin tumor sa obaryo o an paghale kan signal kan TNFα sa mga modelo nin daga puedeng magpakarhay kan produksyon nin inflammatory cytokine na pigpapaagi kan TNFα asin makapugol sa pagtalubo kan tumor (32, 35). Kaya, sa kasong ini, an TME-derived MNA pwedeng mag-akto bilang sarong pro-inflammatory metabolite sa paagi nin sarong TNFα-dependent na mekanismo sa paagi kan autocrine loop, sa siring nagpapauswag kan pangyayari asin paglakop kan kanser sa obaryo (31). Base sa posibilidad na ini, an TNFα blockade pig-aadalan bilang sarong potensyal na terapyutik na ahente para sa kanser sa obaryo (37, 48, 49). Dugang pa, an MNA nakakaraot sa cytotoxicity kan mga selula nin CAR-T sa mga selula nin tumor sa obaryo, na nagtatao nin dugang pang ebidensya para sa MNA-mediated immune suppression. Sa kabilogan, an mga resultang ini nagsusuherir nin sarong modelo kun saen an mga tumor asin mga selula nin CAF nagbubuga nin MNA pasiring sa ekstraselular na TME. Sa paagi kan (i) TNF-induced ovarian cancer growth stimulation asin (ii) MNA-induced T cell cytotoxic activity inhibition, ini pwedeng magkaigwa nin dual tumor effect (Figure 5D).
Sa konklusyon, sa paagi kan pag-aplikar nin kombinasyon nin marikas na pagpayaman kan selula, pagsunod-sunod kan solong selula asin pag-profile kan metabolismo, an pag-aadal na ini naghayag kan dakulang pagkakaiba sa immunometabolomic sa pag-ultanan kan mga tumor asin mga selula nin ascites sa mga pasyenteng HGSC. An komprehensibong pag-analisar na ini nagpahiling na igwa nin mga pagkakaiba sa pag-ako nin glucose asin aktibidad kan mitochondrial sa pag-ultanan kan mga T cell, asin pigmidbid an MNA bilang sarong non-cell autonomous immune regulatory metabolite. An mga datos na ini igwa nin epekto sa kun pano an TME nakakaapektar sa metabolismo kan T cell sa mga kanser sa tawo. Dawa ngani an direktang kompetisyon para sa mga sustansya sa pag-ultanan kan mga selula nin T asin mga selula nin kanser naireport na, an mga metabolite pwede man na magin bakong direktang mga regulador tanganing mapaoswag an pag-uswag kan tumor asin posibleng pugulan an mga endogenous na simbag sa resistensya. An dugang pang paglaladawan kan papel kan mga regulatory metabolite na ini pwedeng magbukas nin mga alternatibong estratehiya para sa pagpapauswag kan anti-tumor immune response.
An mga specimen kan pasyente asin datos klinikal nakua sa paagi kan BC cancer tumor tissue repository na sertipikado kan Canadian Tissue Repository Network. Susog sa protocol na inaprobaran kan BC Cancer Research Ethics Committee asin kan University of British Columbia (H07-00463), an gabos na mga specimen kan mga pasyente asin klinikal na datos nakakua nin may kaaraman na nakasurat na pagtugot o pormal na nag-waive kan saindang pagtugot. An mga sample nakatago sa sertipikadong BioBank (BRC-00290). An detalyadong mga karakteristiko kan pasyente ipinapahiling sa mga Table S1 asin S5. Para sa cryopreservation, an sarong scalpel ginagamit tanganing mekanikal na mabulok an sample kan tumor kan pasyente dangan itulod ini sa sarong 100-micron filter tanganing makakua nin sarong suspensyon nin sarong selula. An ascites kan pasyente pig-centrifuge sa 1500 rpm sa laog nin 10 minutos sa 4°C tanganing i-pellet an mga selula asin mahale an supernatant. An mga selula na nakua sa tumor asin ascites pig-cryopreserve sa 50% heat-inactivated human AB serum (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) asin 10% dimethyl sulfoxide. An mga napreserbar na mga suspensyon nin solong selula na ini tinunaw asin ginamit para sa metabolomics asin pagdeterminar kan metabolite na ilinadawan sa ibaba.
An kumpletong medium igwa nin 0.22 μm na sinala 50:50 na pigdagdagan na RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) na pigdagdagan nin 10% heat-inactivated human AB serum (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) Fiher Scientific x1 Penicillin Streptomycin (PenStrep) na solusyon (Thermo Fisher Scientific) asin 50 μMB-mercaptoethanol. An AimV (Invitrogen) pigdagdagan nin 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) asin 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). An flow cytometer staining buffer igwa nin 0.22μm na sinala na phosphate buffered saline (PBS; Invitrogen) na pigdagdagan nin 3% heat-inactivated AB human serum (Sigma). An cell enrichment buffer kompuesto nin 0.22μm na sinala na PBS asin pigdagdagan nin 0.5% heat-inactivated human AB serum (Sigma-Aldrich).
Sa 37°C na kumpletong medium, an mga selula tinina nin 10 nM MT DR asin 100 μM 2-NBDG sa laog nin 30 minutos. Sunod, an mga selula tinina nin viability dye eF506 sa 4°C sa laog nin 15 minutos. I-resuspend an mga selula sa FC Block (eBioscience) asin Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), lasawon sa flow cytometer staining buffer (susog sa mga instruksyon kan paragibo), asin i-incubate sa laog nin 10 minutos sa temperatura kan kwarto. Mantsahan an mga selula gamit an sarong set nin mga antibodies (Table S2) sa flow cytometry staining buffer sa 4°C sa laog nin 20 minutos. I-resuspend an mga selula sa flow cytometry staining buffer (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) bago an pag-analisar. Gamiton an SpectroFlo asin FlowJo V10 tanganing analisaron an datos kan bilang kan selula, asin gamiton an GraphPad Prism 8 tanganing makagibo kan datos. An median fluorescence intensity (MFI) kan 2-NBDG asin MT DR pig-log-normalize, dangan an sarong paired t test ginamit para sa statistical analysis tanganing ma-account an mga magkaparehong pasyente. Haleon an gabos na populasyon na may mas hababa sa 40 na pangyayari sa pag-analisar; maglaog nin halaga nin MFI na 1 para sa anuman na negatibong halaga bago maggibo nin estadistikal na pag-analisar asin pag-visualize nin datos.
Tanganing madagdagan an estratehiya sa mano-manong pag-gate kan panel kan proseso sa itaas, ginamit niamo an bilog na anotasyon kan shape restriction tree (FAUST) (21) tanganing awtomatikong mag-asignar nin mga selula sa populasyon pagkatapos na mahale an mga gadan na selula sa FlowJo. Mano-mano ming pinamamahalaan an output tanganing pagsararoon an mga populasyon na garo baga dai naka-alokar (pagsasaro kan PD1+ sa mga selula nin PD1-tumor) asin mga napagdanay na populasyon. An lambang sample igwa nin promedyong sobra sa 2% na mga selula, para sa total na 11 populasyon.
An Ficoll gradient density centrifugation ginamit tanganing iseparar an PBMC sa mga produkto nin pagseparar kan leukocyte (STEMCELL Technologies). An mga CD8 + T cells pinagsuway gikan sa PBMC gamit an CD8 MicroBeads (Miltenyi) asin pinalakbang sa kumpletong medium gamit an TransAct (Miltenyi) sa laog nin 2 semana susog sa mga instruksyon kan paragibo. An mga selula tinugutan na magtindog sa laog nin 5 aldaw sa kumpletong medium na igwa nin IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), dangan pig-stimulate giraray gamit an TransAct. Kan ika-7 aldaw, susog sa mga instruksyon kan paragibo, an human CD45 MicroBeads (Miltenyi) ginamit sa pagpayaman kan mga selula sa tolong magkasunod na round. An mga selula pinag-aliquot para sa flow cytometry analysis (siring sa ipinaliwanag sa itaas), asin sarong milyon na selula an pig-aliquot nin tolong beses para sa LC-MS/MS analysis. An mga sample pigproseso sa paagi nin LC-MS/MS siring sa ipinapaliwanag sa ibaba. Tinatantiya niamo an nawawarang halaga kan metabolite na may numero nin ion na 1,000. An lambang sample pig-normalize kan total na numero nin ion (TIC), pigkokombertir sa logaritmo asin awtomatikong pig-normalize sa MetaboAnalystR bago an pag-analisar.
An solong selula na suspensyon kan lambang pasyente tinunaw asin sinala sa paagi nin 40 μm na filter pasiring sa kumpletong medium (siring sa ipinapaliwanag sa itaas). Susog sa protocol kan paragibo, tolong magkasunod na round nin positibong pagpili sa paagi nin magnetic bead separation gamit an MicroBeads (Miltenyi) an ginamit tanganing mapayaman an mga sample para sa CD8+, CD4+ asin CD45- cells (sa yelo). Sa halipot na pagtaram, an mga selula ibinubugtak giraray sa cell enrichment buffer (siring sa ipinaliwanag sa itaas) asin binibilang. An mga selula pig-inkubar sa mga human CD8 beads, human CD4 beads o human CD45 beads (Miltenyi) sa 4°C sa laog nin 15 minutos, dangan hinugasan gamit an cell enrichment buffer. An sample ipinapasa sa LS column (Miltenyi), asin an positibo asin negatibong mga fraction tinipon. Tanganing mabawasan an lawig asin mapadakula an lakdang nin pagbawi kan selula, an CD8-fraction dangan ginagamit para sa ikaduwang hugna kan CD4+ na pagpayaman, asin an CD4-fraction ginagamit para sa kasunod na CD45-enrichment. Ibugtak an solusyon sa yelo sa bilog na proseso nin pagbubulag.
Tanganing maiandam an mga sample para sa pag-analisar kan metabolite, an mga selula hinugasan nin sarong beses gamit an malipot na solusyon nin asin na garo yelo, asin 1 ml nin 80% methanol an idinagdag sa lambang sample, dangan pig-vortex asin pig-snap frozen sa likidong nitroheno. An mga sample isinairarom sa tolong siklo nin pagyelo-pagtunaw asin pig-centrifuge sa 14,000 rpm sa laog nin 15 minutos sa 4°C. An supernatant na igwa kan mga metabolite pig-alisngaw sagkod na mamara. An mga metabolite tinunaw giraray sa 50 μl nin 0.03% formic acid, pig-vortex tanganing maghalo, dangan pig-centrifuge tanganing mahale an mga ati.
Magkua nin mga metabolite siring sa ipinapaliwanag sa itaas. Ibalyo an supernatant sa sarong bote nin halangkaw an performance na liquid chromatography para sa pagsiyasat sa metabolomics. Maggamit nin random na protocol sa pagbolong tanganing trataron an lambang sample na may kaparehong bilang nin mga selula tanganing maibitaran an mga epekto nin batch. Naggibo kami nin sarong kwalitatibong pagtasa kan mga pankinaban na metabolite na dati nang ipinublikar sa AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). An pag-analisar kan chromatographic asin an pag-integrar kan peak area ginibo gamit an MultiQuant version 2.1 software (Applied Biosystems SCIEX).
An bilang kan ion na 1000 ginamit tanganing matantya an nawawarang halaga kan metabolite, asin an TIC kan lambang sample ginamit tanganing makalkulo an normalisadong peak area kan lambang nadetektar na metabolite tanganing itama an mga pagbabago na ipinamidbid kan instrumental na pag-analisar gikan sa pagproseso kan sample. Pagkatapos na ma-normalize an TIC, an MetaboAnalystR(51) (default parameter) ginagamit para sa logarithmic conversion asin automatic norm line scaling. Ginamit niamo an PCA na may vegan R package tanganing maggibo nin eksplorasyon na pag-analisar kan mga pagkakaiba kan metabolome sa pag-oltanan kan mga klase nin sample, asin naggamit nin parsial na redundancy analysis tanganing analisaron an mga pasyente. Gamiton an paagi ni Ward tanganing maggibo nin heat map dendrogram tanganing i-cluster an Euclidean na distansya sa pag-ultanan kan mga sample. Ginamit niamo an limma (52) sa standardized na kadakolan kan metabolite tanganing mamidbid an mga metabolite na magkakalaen an kadakol sa bilog na klase nin selula asin microenvironment. Tanganing mapasimple an paliwanag, ginagamit niamo an group mean parameter tanganing i-espesipikar an modelo, asin pigkokonsiderar an mga klase nin selula sa microenvironment bilang lambang grupo (n = 6 na grupo); para sa pag-eksamin sa kahulugan, naggibo kami nin tolong paorootrong pagsukol para sa lambang metabolite Tanganing maibitaran an salang pagkopya, an pasyente iiniba bilang sarong ulang sa disenyo kan limma. Tanganing ma-check an mga pagkakaiba sa mga metabolite sa pag-ultanan kan manlaen-laen na pasyente, inayos niamo an limma model na kabali an mga pasyente sa sarong nakapirming paagi. Ibinareta niamo an kahulugan kan pre-specified na pagkakaiba sa pag-ultanan kan klase nin selula asin kan microenvironment kan Padj <0.05 (Benjamini-Hochberg correction).
Pagkatapos kan pagpayaman kan vigor gamit an Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% viability), an single-cell transcriptome sequencing ginibo sa total na buhay na nagyelo na ascites asin mga sample nin tumor gamit an 10x 5′gene expression protocol. Limang kaso na may magkaparehong mga tumor asin ascites an inaanalisar, dawa ngani an hababang viability gikan sa sarong sample nin tumor nakaulang sa paglaog kaini. Tanganing makamit an dakol na pagpili nin mga pasyente, pinagsararo niamo an mga sample kan lambang pasyente sa mga lane kan 10x chromium controller, asin inanalisar an mga ascites asin mga lugar nin tumor nin separado. Pagkatapos kan pagsunod-sunod [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genome; an average na 73,488 asin 41,378 na pagbasa kada selula para sa tumor asin ascites sunod-sunod]], ginamit niamo an CellSNP asin Vireo (53) (base sa CellSNP bilang An komun na human SNP (VCF) na itinatao kan GRCh38 tinawan nin donor identity. Ginagamit niamo an SNPRelate tanganing ma-infer an pinakaharaning identidad (IBS) kan genotype kan mga pasyente (IBS) dai kabali an mga dai na-assign na mga selula asin mga selula na namidbid bilang mga duplex asin mga nagtutugma na mga donor sa pag-ultanan kan mga sample nin ascites asin tumor (54). (2792 asin 4183 na mga selula gikan sa tumor asin ascites, sunod-sunod) para sa pag-analisar Ginagamit niamo an igraph's (57) Louvain clustering kan pinag-iribang pinakaharaning network (SNN) base sa distansya ni Jaccard sa mga selula nin cluster sa paagi nin ekspresyon An mga cluster mano-manong pig-annotate sa mga putatibong klase nin selula base sa TNE-toxic na ekspresyon. an mga selula tinatawan nin kahulugan kan ekspresyon kan CD8A asin GZMA, na dai kabali an mga subcluster na may hababang ekspresyon kan protina kan ribosomal.
An PBMC pinagsuhay sa mga produkto nin pagbubulag kan leukocyte (STEMCELL Technologies) sa paagi nin Ficoll gradient density centrifugation. An mga selula nin CD3 + pinagsuway gikan sa PBMC gamit an mga CD3 beads (Miltenyi). Sa presensya o kawaran nin MNA, an mga selula nin CD3+ pig-aktibo gamit an plate-bound CD3 (5μg/ml), soluble CD28 (3μg/ml) asin IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Sa huring aldaw kan pagpahiwas, an viability (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) asin proliferation (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) pig-ebalwar sa paagi nin flow cytometry. Ebalwaron an pagpunsyon kan effector sa paagi nin pagpukaw sa mga selula na may PMA (20 ng/ml) asin ionomycin (1μg/ml) na may GolgiStop sa laog nin 4 na oras, asin bantayan an CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) asin TNFα-fluoresce isothianate (TCMA-T4),1 BD). Pukawon an qPCR asin ChIP cells gamit an PMA (20 ng/ml) asin ionomycin (1μg/ml) sa laog nin 4 na oras. An ELISA supernatant tinipon bago asin pagkatapos kan stimulation gamit an PMA (20 ng/ml) asin ionomycin (1 μg/ml) sa laog nin 4 na oras.
Sundan an protocol kan paragibo tanganing mai-isolate an RNA gamit an RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Gamiton an QIAshredder (QIAGEN) tanganing i-homogenize an sample. Gamiton an high-capacity RNA to cDNA kit (Thermo Fisher Scientific) tanganing makagibo nin komplementaryong DNA (cDNA). Gamiton an TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) tanganing ma-quantify an ekspresyon kan gene (susog sa protocol kan paragibo) gamit an minasunod na mga probe: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs0042755m15155, 2012 Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] asin Hs01010726_m1 (SLC22A2). An mga sample pinadalagan sa StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) sa MicroAmp fast optical 96-well reaction plate (Applied Biosystems) na may MicroAmp optical film. An anuman na halaga nin Ct na minalampas sa 35 pigkokonsiderar na nasa itaas kan threshold nin pagdetektar asin minarkahan bilang dai nahihiling.
Gibohon an ChIP siring sa dati nang ipinaliwanag (58). Sa halipot na pagtaram, an mga selula tinawan nin formaldehyde (huring konsentrasyon 1.42%) asin pig-inkubar sa temperatura kan kwarto sa laog nin 10 minutos. Gamiton an dagdag na swelling buffer (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl asin 0.1% NP-40) sa yelo sa laog nin 10 minutos, dangan i-resuspend sa immunoprecipitation buffer siring sa ipinapaliwanag (58 ). An sample dangan pig-sonicate sa minasunod na mga siklo: 10 siklo (20 1-segundo na pulso) asin sarong estatikong oras na 40 segundo. I-incubate an ChIP-grade immunoglobulin G (Cell Signaling Technology; 1μl), histone H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) asin SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) na mga antibodies sa sample sa 4°CC na yugyugon sa bilog na banggi. I-inkubar an mga kuwintas na protina A (Thermo Fisher Scientific) sa sample sa 4°C na may maluyang pagyugyog sa laog nin 1 oras, dangan gamiton an mga kuwintas na chelex (Bio-Rad) tanganing mapayaman an DNA, asin gamiton an proteinase K (Thermo Fisher) para sa pagtunaw kan protina. An TNFα promoter nadetektar sa paagi nin PCR: paabante, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; sa kabaliktaran, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp na produkto). An mga imahe ginibo kan Image Lab (Bio-Rad) asin pig-quantify gamit an ImageJ software.
An supernatant kan kultura kan selula tinipon siring sa ipinapaliwanag sa itaas. An pagdeterminar ginibo susog sa mga prosedimiento kan paragibo kan human TNFα ELISA kit (Invitrogen), human IL-2 ELISA kit (Invitrogen) asin human IFN-γ ELISA kit (Abcam). Susog sa protocol kan paragibo, an supernatant piglasaw nin 1:100 tanganing mahiling an TNFα asin IL-2, asin 1:3 tanganing mahiling an IFN-γ. Gamiton an EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) tanganing masukol an absorbance sa 450 nm.
An PBMC pinagsuhay sa mga produkto nin pagbubulag kan leukocyte (STEMCELL Technologies) sa paagi nin Ficoll gradient density centrifugation. An mga selula nin CD3 + pinagsuway gikan sa PBMC gamit an mga CD3 beads (Miltenyi). Sa presensya o kawaran nin MNA, an mga selula nin CD3+ pig-aktibo gamit an plate-bound CD3 (5μg/ml), soluble CD28 (3μg/ml) asin IL-2 (300 U/ml; Proleukin) sa laog nin 3 aldaw. Pakalihis nin 3 aldaw, an mga selula tinipon asin hinugasan nin 0.9% na asin, asin an pellet pig-snap frozen. An pagbilang kan selula ginibo sa paagi nin flow cytometry (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) gamit an 123count eBeads.
Magkua nin mga metabolite siring sa ipinapaliwanag sa itaas. An pinatuyong kinuha pigbilog giraray sa konsentrasyon na 4000 na katumbas kan selula/μl. Analisaron an sample sa paagi nin reversed-phase chromatography (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) asin CORTECS T3 column (2.1×150 mm, particle size 1.6-μm, pore size 120-Å; #186008500, Waters). Polar mass spectrometer (6470, Agilent), kun saen an electrospray ionization nag-ooperar sa positibong paagi. An mobile phase A 0.1% formic acid (sa H2O), an mobile phase B 90% acetonitrile, 0.1% formic acid. An LC gradient 0 sagkod 2 minutos para sa 100% A, 2 sagkod 7.1 minutos para sa 99% B, asin 7.1 sagkod 8 minutos para sa 99% B. Dangan i-equilibrate giraray an kolum na may mobile phase A sa flow rate na 0.6 ml/min sa laog nin 3 minutos. . An dalagan kan dalagan 0.4ml/min, asin an silid kan kolum pinapainit sagkod sa 50°C. Gamiton an purong pamantayan sa kemikal kan MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) tanganing establisaron an oras nin pagdanay (RT) asin pagbabago (RT = 0.882 minutos, pagbabago 1 = 137→94.1, pagbabago 2 = 137→92 , Pagkombertir = 13→787). Kun an gabos na tolong transisyon nangyayari sa tamang oras nin pag-iingat, an transisyon 1 ginagamit para sa pagkwantipika tanganing maseguro an pagkaespesipiko. An standard curve kan MNA (Toronto Research Chemical Company) ginibo sa paagi nin anom na serye nin pagtunaw kan stock solution (1 mg/ml) tanganing makakua nin mga pamantayan na 0.1, 1.0, 10 asin 100 ng/ml asin 1.0 asin 10μg/ml nin sunod-sunod na likido. An limitasyon sa pagdetektar 1 ng/ml, asin an linear na simbag yaon sa pag-ultanan kan 10 ng/ml asin 10μg/ml. An lambang ineksiyon nin duwang mikrolitro nin sample asin pamantayan ginagamit para sa pag-analisar kan LC/MS, asin an sarong pinaghalo-halong sample na kontrol sa kalidad pigpapadalagan kada walong ineksyon tanganing maseguro an estabilidad kan plataporma nin pag-analisar. An mga simbag kan MNA kan gabos na sample nin selula na tinawan nin MNA yaon sa laog kan linear na sakop kan assay. An pag-analisar kan datos ginibo gamit an MassHunter quantitative analysis software (v9.0, Agilent).
An ikaduwang henerasyon na αFR-CAR na konstruksyon kinua sa Song et al. (59). Sa halipot na pagtaram, an konstruksyon igwa kan minasunod na mga laog: CD8a leader sequence, human αFR-specific single-chain variable fragment, CD8a hinge asin transmembrane region, CD27 intracellular domain asin CD3z intracellular domain. An kumpletong CAR sequence pig-synthesize kan GenScript, dangan pig-clone sa ikaduwang henerasyon na lentiviral expression vector sa itaas kan GFP expression cassette na ginamit sa pag-ebalwar kan transduction efficiency.
An lentivirus nagigibo sa paagi nin transfeksyon kan mga selula nin HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); pinadakula sa Dulbecco's modified Eagle medium na igwa nin 10% fetal bovine serum (FBS) asin 1% PenStrep, asin naggamit nin CAR-GFP vector asin An mga packaging plasmid (psPAX2 asin pMD2.G, Addgene) naggagamit nin lipofection amine (Sigma-Aldrich). An supernatant na igwa nin virus tinipon 48 asin 72 oras pagkatapos kan transfection, sinala, asin pigkonsentrar sa paagi nin ultracentrifugation. Itago an konsentradong viral supernatant sa -80°C sagkod sa transduction.
An mga PBMC pinagbubulag sa mga produkto nin pagbubulag kan leukocyte kan mga marahay na donor (STEMCELL Technologies) sa paagi nin Ficoll gradient density centrifugation. Gamiton an positibong pagpili nin CD8 microbeads (Miltenyi) tanganing ibulag an mga selula nin CD8+ gikan sa PBMC. Pukawon an mga selula nin T gamit an TransAct (Miltenyi) asin sa TexMACS medium [Miltenyi; pigdagdagan nin 3% heat-inactivated human serum, 1% PenStrep asin IL-2 (300 U/ml)]. Beinte-kwatro oras pagkatapos kan stimulation, an mga T cell pig-transduce gamit an lentivirus (10 μl na konsentradong supernatant kan virus kada 106 na selula). 1 sagkod 3 aldaw pagkatapos kan transduksyon sa Cytek Aurora (sa FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), ebalwaron an ekspresyon kan GFP kan mga selula tanganing maipahiling an transduction efficiency na dai mababa sa 30% .
An mga selula nin CAR-T pigkultibar sa laog nin 24 oras sa Immunocult (STEMCELL Technologies; pigdagdagan nin 1% PenStrep) sa irarom kan minasunod na mga kondisyon: dai tinatrato, tinatrato nin 250 μM adenosine o 10 mM MNA. Pagkatapos kan pretreatment, an mga selula nin CAR-T hinugasan gamit an PBS asin pinagsararo sa 20,000 na selula nin SK-OV-3 [ATCC; sa McCoy 5A medium (Sigma-Aldrich) na pigdagdagan nin 10% FBS asin 1% PenStrep sa 10: An effector to target ratio na 1 pig-amplify sa triplicate sa pigdagdagan na Immunocult medium. An mga selula nin SK-OV-3 asin mga selula nin SK-OV-3 na na-lyse gamit an digitalis saponin (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) ginamit bilang negatibo asin positibong mga kontrol, sunod-sunod. Pakalihis nin 24 oras nin pag-iribang pagkultibar, an supernatant tinipon asin an lactate dehydrogenase (LDH) sinusukol susog sa mga instruksyon kan paragibo (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). An LDH supernatant piglasaw nin 1:50 sa LDH buffer. An porsyento nin paggadan sinusukol gamit an minasunod na pormula: porsyento nin paggadan = porsyento nin pagkorehir / pinakahalangkaw na bilang nin paggadan x 100%, kun saen porsyento nin pagtatanos = co-culture-T cells sana, asin pinakahalangkaw na bilang nin paggadan = positibong kontrol-negatibong kontrol.
Siring sa ipinapaliwanag sa teksto o mga materyales asin mga paagi, gamiton an GraphPad Prism 8, Microsoft Excel o R v3.6.0 para sa estadistikal na pag-analisar. Kun an dakol na sample nakolekta gikan sa parehong pasyente (arog kan ascites asin tumor), naggagamit kami nin sarong pares na t test o iiba an pasyente bilang sarong random na epekto sa sarong linear o heneralisadong modelo kun angay. Para sa pag-analisar kan metabolomics, an importansya na pag-eksamin ginigibo sa tolong kopya.
Para sa mga dagdag na materyales para sa artikulong ini, hilingon an http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Ini sarong open access na artikulo na ipinapanao sa irarom kan mga termino kan Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, na nagtutugot kan paggamit, distribusyon asin reproduksyon sa arin man na medium, basta an pinal na paggamit bakong para sa komersyal na ganansya asin an premisa iyo na an orihinal na obra tama. Reperensiya.
Tandaan: Hinahagad mi sana saimo na itao mo an saimong email address tanganing maaraman kan tawong saimong irinerekomendar sa page na gusto mong mahiling ninda an email asin na bako ining spam. Dai kami makakakua nin anuman na mga email address.
An hapot na ini ginagamit tanganing maprobaran kun ika sarong bisita asin maibitaran an awtomatikong pagsusumite nin spam.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephrini (R.R.R. Bellnis), Dephral Deph. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
An MNA nagkokontribwir sa pagsugpo kan resistensya kan mga selula nin T asin nagrerepresentar nin sarong potensyal na target nin immunotherapy para sa pagbolong kan kanser sa tawo.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephrini (R.R.R. Bellnis), Dephral Deph. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
An MNA nagkokontribwir sa pagsugpo kan resistensya kan mga selula nin T asin nagrerepresentar nin sarong potensyal na target nin immunotherapy para sa pagbolong kan kanser sa tawo.
©2021 American Association for the Advancement of Science. gabos na deretso reserbado. An AAAS sarong partner kan HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef asin COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.